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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la limpieza óptica rápida y simultánea, el marcaje multirredondo y la reconstrucción volumétrica en 3D de decenas de secciones cerebrales humanas postmortem mediante la combinación de la técnica de transformación tisular corta (S WITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) con imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz en un protocolo rutinario de alto rendimiento.

Resumen

A pesar de las numerosas técnicas de aclaramiento que surgieron en la última década, el procesamiento de cerebros humanos post mortem sigue siendo una tarea desafiante debido a sus dimensiones y complejidad, que hacen que las imágenes con resolución micrométrica sean particularmente difíciles. En este trabajo se presenta un protocolo para realizar la reconstrucción de porciones volumétricas del cerebro humano mediante el procesamiento simultáneo de decenas de secciones con el protocolo de transformación tisular SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]), que permite la limpieza, el etiquetado y la obtención de imágenes secuenciales de las muestras con microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). SHORT proporciona una rápida limpieza de tejidos y un etiquetado múltiple homogéneo de cortes gruesos con varios marcadores neuronales, lo que permite la identificación de diferentes subpoblaciones neuronales tanto en la sustancia blanca como en la gris. Después del borrado, las cortes se visualizan a través de LSFM con resolución micrométrica y en múltiples canales simultáneamente para una rápida reconstrucción en 3D. Al combinar SHORT con el análisis LSFM dentro de un protocolo rutinario de alto rendimiento, es posible obtener la reconstrucción de la citoarquitectura 3D de grandes áreas volumétricas a alta resolución en poco tiempo, lo que permite una caracterización estructural integral del cerebro humano.

Introducción

El análisis de la organización molecular 3D y la citoarquitectura de grandes volúmenes del cerebro humano requiere transparencia óptica de las muestras, lograda a través de protocolos con un tiempo de procesamiento extenso. Se desarrollaron técnicas de aclaramiento óptico para minimizar la heterogeneidad en el índice de refracción (IR) dentro de los tejidos, reduciendo así la dispersión de la luz y aumentando la profundidad de penetración de la luz para obtener imágenes de alta resolución 1,2,3,4,5. Los avances actuales en los métodos de limpieza y marcaje profundo de tejidos permiten obtener imágenes volumétricas de órganos y embriones de roedores intactos mediante la explotación de técnicas de microscopía de vanguardia 6,7,8,9,10,11,12.

Sin embargo, la reconstrucción volumétrica en 3D de grandes áreas del cerebro humano postmortem sigue representando una tarea difícil en comparación con los organismos modelo. La compleja composición biológica y las variables condiciones de fijación y almacenamiento postmortem pueden comprometer la eficiencia de limpieza de tejidos, la profundidad de penetración de anticuerpos y el reconocimiento de epítopos 13,14,15,16,17,18,19. Además, el corte mecánico de los tejidos y el posterior aclarado y etiquetado de cada rebanada siguen siendo necesarios para lograr un desbroce eficiente y un etiquetado uniforme de grandes áreas del cerebro humano, lo que resulta en largos tiempos de procesamiento y en la necesidad de equipos personalizados sofisticados, en comparación con los organismos modelo 15,20,21,22.

La técnica de transformación tisular SWITCH - H2O2 - antígeno Retrieval -TDE (SHORT) ha sido desarrollada específicamente para analizar grandes volúmenes del cerebro humano18,23. Este método emplea la preservación estructural tisular del protocolo SWITCH11 y altas concentraciones de peróxido de hidrógeno para disminuir la autofluorescencia tisular, en combinación con la restauración de epítopos. SHORT permite la tinción uniforme de cortes de cerebro humano con marcadores para diferentes subtipos neuronales, células gliales, vasculatura y fibras mielinizadas18,24. Sus resultados son compatibles con el análisis de proteínas de baja y alta densidad. Los altos niveles de transparencia resultantes y el etiquetado uniforme permiten la reconstrucción volumétrica de cortes gruesos con microscopía de fluorescencia, en particular, para una adquisición rápida se pueden utilizar aparatos de láminas ligeras 18,24,25,26,27.

En este trabajo, describimos cómo se puede utilizar la técnica de transformación tisular SHORT para la limpieza simultánea y el etiquetado multirredondo de decenas de secciones cerebrales humanas fijadas en formol. Se pueden utilizar cuatro marcadores fluorescentes diferentes juntos, lo que lleva a la identificación de diferentes subpoblaciones celulares. Después del aclaramiento, se pueden realizar imágenes volumétricas de alta resolución con microscopía de fluorescencia. En este caso, utilizamos un LSFM invertido 18,24,25,26,27 hecho a medida, que permite un rápido corte óptico de la muestra y una rápida adquisición de múltiples canales en paralelo. Con este protocolo rutinario de alto rendimiento, es posible obtener una caracterización celular y estructural completa con una resolución subcelular de grandes áreas del cerebro humano, como ya se demostró en el mapeo de toda un área de Broca23.

Protocolo

El Departamento de Neuropatología del Servicio de Autopsias del Hospital General de Massachusetts (MGH) (Boston, EE.UU.) proporcionó muestras de tejido humano fijadas en formol. Se obtuvo el consentimiento por escrito de los participantes sanos antes de la muerte, siguiendo los protocolos de recolección de tejidos aprobados por el IRB del Comité de Bioseguridad Institucional de Socios (PIBC, protocolo 2003P001937). Los documentos de autorización se conservan en los Servicios de Autopsia de MGH en Boston, MA, Estados Unidos, y están disponibles a pedido.

1. Inclusión de agarosa y corte de muestras

  1. Prepare una solución de agarosa al 4% p/v en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, pH 7,4) en un vaso de precipitados e incruste el bloque de tejido en su interior. Espere hasta que alcance la temperatura ambiente (RT) y luego guárdelo a 4 °C durante 24 h.
  2. Para obtener secciones de alta precisión, pegue la muestra al disco de muestra del vibrátomo y llene la bandeja con 1x PBS frío (pH 7,4). Ajustar los parámetros del vibrátomo, como la frecuencia, la amplitud y la velocidad, según el tipo de tejido a cortar (valores utilizados: frecuencia = 5 (50 Hz); amplitud = 0,4; velocidad = 3 (0,15 mm/s).
    NOTA: Se deben utilizar diferentes vibrátomos dependiendo del volumen de la muestra. Para muestras con un volumen máximo de 70 x 40 x 15 mm, se puede utilizar un vibrátomo (por ejemplo, Leica VT1000 S); para muestras más grandes, es posible utilizar un compresótomo (por ejemplo, VF-900-0Z Microtomo18) o un aparato hecho a medida21. Aquí, presentamos lonchas cortadas con un grosor de 400 μm o 500 μm.
  3. Después del corte, coloque todas las rodajas en una solución conservadora compuesta por 1x PBS (pH 7,4) con 0,01% p/v de azida sódica (NaN3) y almacene a 4 °C.
    NOTA: Antes de incrustar, espere hasta que la solución de agarosa alcance los 37 °C. Una temperatura más alta podría dañar la muestra. Se recomienda no dejar las muestras en PFA durante más de 48 h, ya que la fijación prolongada podría interferir con el procedimiento de marcaje al dañar los antígenos y aumentar la autofluorescencia tisular. Para el almacenamiento a largo plazo de tejidos humanos, se utiliza PBS con NaN3 para prevenir la contaminación microbiana. Debido a la toxicidad del NaN3, prepare la solución conservadora bajo una cubierta química.

2. Fijación tisular

NOTA: Todas las soluciones utilizadas en el siguiente protocolo se preparan en grandes volúmenes, suficientes para procesar todos los cortes del mismo bloque tisular y minimizar la variabilidad técnica y reducir el tiempo de los pasos individuales.

  1. Prepare la solución de desconexión con 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0,1 M de ácido clorhídrico (HCl), 25% v/v 0,1 M de ftalato de hidrógeno de potasio (KHP) y glutaraldehído fresco al 4% v/v. Colocar todas las muestras en platos con tapa de rosca (70 x 23 mm) e incubarlas con la solución Switch-off agitando suavemente a 4 °C durante 1 día, protegiéndolas de la luz con papel de aluminio.
  2. Prepare la solución de encendido con 1x PBS (pH 7,4) y glutaraldehído fresco al 1% v/v. Coloque todas las muestras en platos nuevos e incubelas con la solución Switch-on agitando suavemente a 4 °C durante 1 día, protegiéndolas de la luz con papel de aluminio.
    NOTA: Debido a la alta toxicidad y sensibilidad a la luz del glutaraldehído, tanto las soluciones de apagado como las de encendido deben prepararse siempre frescas y mantenerse bajo la cubierta química en hielo. Llene siempre el plato con 20 ml de cada solución y séllelo con parafilm.

3. Inactivación y borrado

NOTA: El glutaraldehído reactivo en las muestras debe ser inactivado por incubación con una solución de inactivación que consista en 1x PBS pH 7.4, 4% p/v acetamida, 4% p/v glicina, pH 9.0. La solución puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 3 meses. Para eliminar los lípidos y hacer que el tejido sea transparente, utilizamos la solución de limpieza que consiste en 200 mM de dodecil sulfato de sodio (SDS), 20 mM de sulfito de sodio (Na2SO3) y 20 mM de ácido bórico (H3BO3), pH 9.0. La solución debe almacenarse a RT a medida que la FDS precipita a 4 °C. Todos los pasos siguientes se realizarán en tubos llenos de la solución.

  1. Mover las muestras de los platos a los tubos y lavar durante 3 x 2 h con 1x PBS pH 7.4 a RT agitando suavemente.
    NOTA: Para el paso 3.1, es necesario trabajar bajo la cubierta química debido a la toxicidad del glutaraldehído. La acetamida, el SDS y el ácido bórico también son reactivos tóxicos y deben manipularse bajo una cubierta química. Llene siempre el tubo con 50 ml de cada solución.
  2. Incubar las muestras en solución de inactivación a 37 °C en un baño de agua durante la noche (o/n).
  3. Lavar durante 3 x 2 h en 1x PBS pH 7.4 a RT agitando suavemente.
  4. Incubar las muestras en solución aclarante a 55 °C en un baño de agua durante 3-7 días. Cambie la solución cada 2 días (Tabla 1).

4. Inmunomarcaje

NOTA: Antes del paso de etiquetado, es necesario eliminar la SDS residual, reducir la autofluorescencia y desenmascarar los epítopos con una solución de recuperación de antígenos que consta de 10 mM de base de Tris, 1 mM de EDTA y 0,05% v/v Tween 20, pH 9. El pH de la solución de 9 está optimizado para un proceso de recuperación eficiente; La base de Tris actúa como agente amortiguador para mantener un entorno de pH estable; El EDTA, que es un agente quelante, mejora la accesibilidad del antígeno. El detergente no iónico Tween 20 ayuda a mejorar la permeabilidad del tejido. Esta solución puede almacenarse a 4 °C. Es importante tener en cuenta que el peróxido de hidrógeno combinado con la etapa de recuperación de antígenos tiene un efecto sinérgico en la reducción de la señal de autofluorescencia, al descomponer y/o modificar los fluoróforos endógenos responsables de la señal de fondo no específica (como la lipofuscina).

  1. Preparar 1x PBS con Triton X-100 (PBST) al 0,1 % v/v, precalentarlo a 37 °C y lavar las muestras 3 x 3 h durante el día agitando suavemente a 37 °C en la incubadora. Dejar el último lavado o/n.
    NOTA: Almacene la solución madre de PBST a 4 °C. Es crucial eliminar el SDS del tejido, ya que puede formar precipitados insolubles a bajas temperaturas que pueden interferir con los procesos de adquisición posteriores.
  2. Al día siguiente, añadir 10 ml de peróxido de hidrógeno al 30% v/v (H2O2) a cada muestra y dejarla agitar suavemente a RT durante 45 min.
  3. Lavar 3 x 10 min con 1x PBS (pH 7.4) agitando suavemente a RT.
  4. Precalentar la solución de recuperación de antígenos a 95 °C en un baño de agua; transferir las muestras a la solución calentada y dejarlas a 95 °C durante 10 min.
  5. Deje que las muestras se enfríen a RT durante 40 minutos agitándolas suavemente.
  6. Lavar 3 x 5 min con agua desionizada agitando suavemente.
  7. Equilibrar las muestras en PBS a 4 °C durante 15 min.
  8. Prepare una solución de anticuerpos fresca hecha de PBST con NaN3 al 0,01% p/v (consulte la NOTA para el paso 1.3) y agregue anticuerpos primarios. Incubar las muestras con la solución en placas con tapas de rosca a 37 °C durante n días (1-7) en una incubadora con agitación suave y protección contra la luz (Tabla 2).
    NOTA: El tiempo de incubación depende del tamaño y el espesor (Tabla 1 y Tabla 2).
  9. Después de n días, mover las muestras a tubos y lavar 3 x 2 h con PBST precalentado a 37 °C agitando suavemente en la incubadora.
  10. Añadir anticuerpos secundarios en PBST con NaN3 al 0,01% p/v e incubar las muestras en placas nuevas con tapas de rosca a 37 °C durante n días (1-6) en una incubadora con agitación suave y protegida de la luz (Tabla 1 y Tabla 2).
  11. Después de n días, transfiera las muestras a tubos y lave 3 x 3 h durante el día con PBST precalentado a 37 °C en una incubadora de agitación suave. Dejar el último lavado o/n.
    NOTA: Como Triton X-100 y Tween 20 son viscosos, pipetee lentamente para permitir que la punta se llene. Llene siempre el tubo con 50 ml de cada solución. Use 10 ml de soluciones de anticuerpos para cada muestra y selle la placa con parafilm para evitar la evaporación de la solución. Dado que las soluciones de anticuerpos contienen NaN3, pueden almacenarse a 4 °C y reutilizarse para etiquetar nuevas muestras en un plazo de 2 semanas.

5. Coincidencia del índice de refracción

NOTA: Para lograr un alto nivel de transparencia, es necesario homogeneizar el índice de refracción tisular. Aquí utilizamos 2,2'-tiodietanol (TDE) diluido en 1x PBS. Las soluciones TDE deben almacenarse en RT.

  1. Transfiera las muestras a platos nuevos, agregue un 30% v/v de TDE y déjelas durante 4 h agitando suavemente a RT.
  2. Retire la solución de TDE al 30% v/v, agregue TDE al 68% v/v a las muestras y déjelas agitar suavemente en RT.
    NOTA: Como el TDE es viscoso, pipetee lentamente para permitir que la punta se llene. La inhalación de vapor o neblina de TDE puede irritar el sistema respiratorio. Por lo tanto, es recomendable trabajar en un área bien ventilada o usar campanas extractoras para minimizar la exposición. Las soluciones de TDE deben almacenarse en RT. Utilice 10 ml de soluciones de TDE para cada muestra.

6. Montaje de la muestra

NOTA: Para facilitar el montaje de la muestra y la adquisición de imágenes LSFM, utilizamos un portamuestras sellado hecho a medida (denominado "sándwich"), que consta de tres partes: un portaobjetos de microscopio, un espaciador y un cubreobjetos.

  1. Coloque el espaciador de acero (56 x 56 x 0,5 mm3) sobre el portaobjetos del microscopio (60 x 60 x 1 mm3) y coloque la muestra sobre el portaobjetos de microscopía.
  2. Coloque con cuidado el cubreobjetos de cuarzo (60 x 60 x 0,5 mm3), sujete todo junto y prepare un pegamento de silicona de dos componentes en una proporción de 1:1. Utilice un cubreobjetos de cuarzo para que coincida con el índice de refracción y reduzca la aberración óptica durante el proceso de adquisición.
  3. Con una jeringa de 1 ml, rellene el espacio entre el espaciador y el cubreobjetos con un pegamento de silicona de dos componentes y déjelo secar durante 10 minutos.
  4. Retire los clips y use una aguja pequeña para llenar lentamente todo el sándwich con 68% v/v TDE.
  5. Haz pegamento fresco y sella el sándwich.
    NOTA: Si el TDE llega accidentalmente al espaciador en el paso 6.1, el pegamento no se curará. Asegúrese de que no se formen burbujas de aire durante el paso 6.2.

7. Decapado

NOTA: La preservación estructural y la accesibilidad mejorada de los epítopos de SHORT permiten el marcaje multirredondo de cortes mediante la eliminación de los anticuerpos y la retinción de las muestras con otros marcadores.

  1. Abra el sándwich con una cuchilla, coloque las muestras en platos nuevos con tapas de rosca llenas con 30% v/v TDE y déjelos durante 3 h.
  2. Transfiera las muestras a tubos, lave durante 3 x 2 h en 1x PBS (pH 7.4) a RT con una agitación suave y deje el último lavado o/n.
  3. Colocar las muestras en solución aclarante en un baño de agua a 80 °C durante 4 h.
  4. Lavar durante 3 x 2 h en 1x PBST (pH 7,4) a 37 °C agitando suavemente y dejar el último lavado o/n. Ahora la muestra está lista para ser etiquetada de nuevo a partir del paso 4.8.
    NOTA: Llene siempre el tubo con 50 ml de cada solución. Utilice 10 ml de solución de TDE para cada muestra.

Resultados

El protocolo aquí descrito permite el tratamiento simultáneo de múltiples cortes, con espesores de 100 μm a 500 μm, utilizando el método SHORT. Este enfoque reduce significativamente el tiempo total de procesamiento de todo el procedimiento. En este trabajo, proporcionamos una descripción completa de toda la tubería (Figura 1) para procesar múltiples secciones gruesas de cerebro humano postmortem simultáneamente y demostramos el protocolo en 24 cortes a la vez (

Discusión

Las imágenes de alta resolución y la reconstrucción en 3D de grandes áreas del cerebro humano requieren un corte mecánico de tejido seguido de un aclarado óptico y un inmunomarcaje de cortes individuales. El protocolo presentado aquí describe cómo se puede utilizar el método de transformación tisular SHORT para el procesamiento rápido y simultáneo de múltiples secciones gruesas del cerebro humano para la reconstrucción cerebral en 3D con una resolución subcelular con LSFM.

A dif...

Divulgaciones

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Bruce Fischl, Hospital General de Massachusetts, Centro de Imágenes Biomédicas A.A. Martinos, Departamento de Radiología, por proporcionar las muestras de cerebro humano analizadas en este estudio. Este proyecto recibió financiación del Programa Marco de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención n.º 654148 (Laserlab-Europe), del Programa Marco de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de Subvención Específico n.º 785907 (Proyecto Cerebro Humano SGA2) y N.º 945539 (Proyecto Cerebro Humano SGA3), del Centro de la Corporación Hospitalaria General de los Institutos Nacionales de Salud (PGN) con el número de adjudicación U01 MH117023, y del Ministerio de Educación italiano en el marco del Nodo Italiano de Euro-Bioimagen (infraestructura de investigación ESFRI). Finalmente, esta investigación se llevó a cabo con la contribución de la "Fondazione CR Firenze". El contenido de este trabajo es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. La figura 1 se creó con BioRender.com.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2'-thiodiethanolMerck Life Science S.R.L.166782
Acetamide >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Boric AcidMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateMerck Life Science S.R.L.E5134
GlutaraldehydeMerck Life Science S.R.L.G7651
GlycineSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Hydrogen Peroxide 30%Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075Lab companion /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)//custom-made
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Microscope slidesLaborchimica/customized
Phospate buffer saline tabletMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002out of production
Potassium Hydrogen PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
Sodium AzideMerck Life Science S.R.L.S2002
Sodium Dodecyl SulfateMerck Life Science S.R.L.L3771
Sodium SulfiteMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlcustomized
Sputum Containers (dishes with screw lids)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (ITW reagents)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
TubesSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Water bath MemmertWNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Dilution used, 1:200
Anti-NeuN AntibodyMerck Life Science S.R.L.ABN91Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)Abcamab32895Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)Abcamab8069Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibodyProteinTech12278_1_APDilution used, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbedAbcamab175475Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibodyAbcamab194324Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)ProteinTech16233-1-APDilution used, 1:200

Referencias

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