Aclarado óptico y etiquetado para microscopía de fluorescencia de lámina de luz en imágenes cerebrales humanas a gran escala

Resumen

El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la limpieza óptica rápida y simultánea, el marcaje multirredondo y la reconstrucción volumétrica en 3D de decenas de secciones cerebrales humanas postmortem mediante la combinación de la técnica de transformación tisular corta (S WITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) con imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz en un protocolo rutinario de alto rendimiento.

Resumen

A pesar de las numerosas técnicas de aclaramiento que surgieron en la última década, el procesamiento de cerebros humanos post mortem sigue siendo una tarea desafiante debido a sus dimensiones y complejidad, que hacen que las imágenes con resolución micrométrica sean particularmente difíciles. En este trabajo se presenta un protocolo para realizar la reconstrucción de porciones volumétricas del cerebro humano mediante el procesamiento simultáneo de decenas de secciones con el protocolo de transformación tisular SHORT (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]), que permite la limpieza, el etiquetado y la obtención de imágenes secuenciales de las muestras con microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). SHORT proporciona una rápida limpieza de tejidos y un etiquetado múltiple homogéneo de cortes gruesos con varios marcadores neuronales, lo que permite la identificación de diferentes subpoblaciones neuronales tanto en la sustancia blanca como en la gris. Después del borrado, las cortes se visualizan a través de LSFM con resolución micrométrica y en múltiples canales simultáneamente para una rápida reconstrucción en 3D. Al combinar SHORT con el análisis LSFM dentro de un protocolo rutinario de alto rendimiento, es posible obtener la reconstrucción de la citoarquitectura 3D de grandes áreas volumétricas a alta resolución en poco tiempo, lo que permite una caracterización estructural integral del cerebro humano.

Introducción

El análisis de la organización molecular 3D y la citoarquitectura de grandes volúmenes del cerebro humano requiere transparencia óptica de las muestras, lograda a través de protocolos con un tiempo de procesamiento extenso. Se desarrollaron técnicas de aclaramiento óptico para minimizar la heterogeneidad en el índice de refracción (IR) dentro de los tejidos, reduciendo así la dispersión de la luz y aumentando la profundidad de penetración de la luz para obtener imágenes de alta resolución 1,2,3,4,5. Los ava....

Protocolo

El Departamento de Neuropatología del Servicio de Autopsias del Hospital General de Massachusetts (MGH) (Boston, EE.UU.) proporcionó muestras de tejido humano fijadas en formol. Se obtuvo el consentimiento por escrito de los participantes sanos antes de la muerte, siguiendo los protocolos de recolección de tejidos aprobados por el IRB del Comité de Bioseguridad Institucional de Socios (PIBC, protocolo 2003P001937). Los documentos de autorización se conservan en los Servicios de Autopsia de MGH en Boston, MA, Estados Unidos, y están disponibles a pedido.

1. Inclusión de agarosa y corte de muestras

1. Prepare una soluc....

Discusión

Las imágenes de alta resolución y la reconstrucción en 3D de grandes áreas del cerebro humano requieren un corte mecánico de tejido seguido de un aclarado óptico y un inmunomarcaje de cortes individuales. El protocolo presentado aquí describe cómo se puede utilizar el método de transformación tisular SHORT para el procesamiento rápido y simultáneo de múltiples secciones gruesas del cerebro humano para la reconstrucción cerebral en 3D con una resolución subcelular con LSFM.

A dif.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200