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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.

Abstract

Nonostante le numerose tecniche di clearing emerse nell'ultimo decennio, l'elaborazione post-mortem del cervello umano rimane un compito impegnativo a causa delle sue dimensioni e complessità, che rendono particolarmente difficile l'imaging con risoluzione micrometrica. Questo articolo presenta un protocollo per eseguire la ricostruzione di porzioni volumetriche del cervello umano elaborando simultaneamente decine di sezioni con il protocollo di trasformazione tissutale SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), che consente la clearing, la marcatura e l'imaging sequenziale dei campioni con microscopia a fluorescenza a foglio di luce (LSFM). SHORT fornisce una rapida pulizia dei tessuti e una marcatura multipla omogenea di fette spesse con diversi marcatori neuronali, consentendo l'identificazione di diverse sottopopolazioni neuronali sia nella materia bianca che in quella grigia. Dopo la pulizia, le fette vengono visualizzate tramite LSFM con risoluzione micrometrica e in più canali contemporaneamente per una rapida ricostruzione 3D. Combinando l'analisi SHORT con LSFM all'interno di un protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere la ricostruzione della citoarchitettura 3D di grandi aree volumetriche ad alta risoluzione in breve tempo, consentendo così una caratterizzazione strutturale completa del cervello umano.

Introduzione

L'analisi dell'organizzazione molecolare 3D e della citoarchitettura di grandi volumi del cervello umano richiede la trasparenza ottica dei campioni, ottenuta attraverso protocolli con tempi di elaborazione estesi. Le tecniche di compensazione ottica sono state sviluppate per ridurre al minimo l'eterogeneità dell'indice di rifrazione (RI) all'interno dei tessuti, riducendo così la dispersione della luce e aumentando la profondità di penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione 1,2,3,4,5. Gli attuali progressi nei metodi di clearing e marcatura dei tessuti profondi consentono l'imaging volumetrico di organi ed embrioni di roditori intatti sfruttando tecniche di microscopia all'avanguardia 6,7,8,9,10,11,12.

Tuttavia, la ricostruzione volumetrica 3D di vaste aree del cervello umano post-mortem rappresenta ancora un compito impegnativo rispetto agli organismi modello. La complessa composizione biologica e le variabili condizioni di fissazione e conservazione post-mortem possono compromettere l'efficienza di eliminazione dei tessuti, la profondità di penetrazione degli anticorpi e il riconoscimento dell'epitopo 13,14,15,16,17,18,19. Inoltre, il sezionamento meccanico dei tessuti e la successiva pulizia ed etichettatura di ogni fetta sono ancora necessari per ottenere una pulizia efficiente e un'etichettatura uniforme di grandi aree cerebrali umane, con conseguenti lunghi tempi di lavorazione e la necessità di sofisticate apparecchiature personalizzate, rispetto agli organismi modello 15,20,21,22.

La tecnica di trasformazione tissutale SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) è stata sviluppata specificamente per analizzare grandi volumi del cervello umano18,23. Questo metodo impiega la conservazione strutturale dei tessuti del protocollo SWITCH11 e alte concentrazioni di perossido di idrogeno per ridurre l'autofluorescenza tissutale, in combinazione con il ripristino dell'epitopo. SHORT consente una colorazione uniforme di fette di cervello umano con marcatori per diversi sottotipi neuronali, cellule gliali, vascolarizzazione e fibre mieliniche18,24. I suoi risultati sono compatibili con l'analisi di proteine sia a bassa che ad alta densità. Gli elevati livelli di trasparenza che ne derivano e l'etichettatura uniforme consentono la ricostruzione volumetrica di fette spesse con microscopia a fluorescenza, in particolare, per l'acquisizione rapida è possibile utilizzare apparecchi a foglio di luce 18,24,25,26,27.

In questo lavoro, descriviamo come la tecnica di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzata per la pulizia simultanea e l'etichettatura multi-round di decine di sezioni di cervello umano fissate in formalina. Quattro diversi marcatori fluorescenti possono essere utilizzati insieme, portando all'identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari. Dopo la pulizia, è possibile eseguire l'imaging volumetrico ad alta risoluzione con microscopia a fluorescenza. In questo caso, abbiamo utilizzato un LSFM invertito su misura 18,24,25,26,27, che consente un rapido sezionamento ottico del campione e una rapida acquisizione di più canali in parallelo. Con questo protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere una caratterizzazione cellulare e strutturale completa con una risoluzione sub-cellulare di vaste aree del cervello umano, come già dimostrato nella mappatura di un'intera area di Broca23.

Protocollo

Campioni di tessuto umano fissati in formalina sono stati forniti dal Dipartimento di Neuropatologia del Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Il consenso scritto è stato ottenuto dai partecipanti sani prima della morte, seguendo i protocolli di raccolta dei tessuti approvati dall'IRB dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza dei Partner (PIBC, protocollo 2003P001937). I documenti di autorizzazione sono conservati presso il MGH Autopsy Services di Boston, MA, Stati Uniti, e sono disponibili su richiesta.

1. Inclusione dell'agarosio e taglio del campione

  1. Preparare una soluzione di agarosio al 4% p/v in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) in un becher e incorporare il blocco di tessuto all'interno. Attendere che raggiunga la temperatura ambiente (RT) e poi conservare a 4 °C per 24 ore.
  2. Per ottenere sezioni di alta precisione, incollare il campione al disco del vibratomo e riempire il vassoio con PBS freddo 1x (pH 7,4). Regolare i parametri del vibratomo come frequenza, ampiezza e velocità in base al tipo di tessuto da affettare (valori utilizzati: frequenza = 5 (50 Hz); ampiezza = 0,4; velocità = 3 (0,15 mm/s).
    NOTA: È necessario utilizzare vibratomi diversi a seconda del volume del campione. Per campioni con un volume massimo di 70 x 40 x 15 mm, è possibile utilizzare un vibratomo (ad es. Leica VT1000 S); per campioni più grandi, è possibile utilizzare un compresstomo (ad es. VF-900-0Z Microtomo18) o un apparecchio personalizzato21. Qui presentiamo fette tagliate con uno spessore di 400 μm o 500 μm.
  3. Dopo il taglio, mettere tutte le fette in una soluzione conservante composta da 1x PBS (pH 7,4) con 0,01% p/v di Sodio Azide (NaN3) e conservare a 4 °C.
    NOTA: Prima dell'inclusione, attendere che la soluzione di agarosio raggiunga i 37 °C. Una temperatura più elevata potrebbe danneggiare il campione. Si raccomanda di non lasciare i campioni in PFA per più di 48 ore poiché una fissazione prolungata potrebbe interferire con la procedura di marcatura danneggiando gli antigeni e aumentando l'autofluorescenza dei tessuti. Per la conservazione a lungo termine dei tessuti umani, il PBS con NaN3 viene utilizzato per prevenire la contaminazione microbica. A causa della tossicità di NaN3, preparare la soluzione conservante sotto una cappa chimica.

2. Fissazione tissutale

NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate nel seguente protocollo sono preparate in grandi volumi, sufficienti per processare tutte le fette dello stesso blocco di tessuto e minimizzare la variabilità tecnica e ridurre i tempi per i singoli passaggi.

  1. Preparare la soluzione di spegnimento con il 50% v/v 1x PBS pH 3, il 25% v/v 0,1 M di acido cloridrico (HCl), il 25% v/v 0,1 M di idrogeno ftalato di potassio (KHP) e il 4% v/v di glutaraldeide fresca al 4%. Porre tutti i campioni in piastre con coperchio a vite (70 x 23 mm) e incubarli con la soluzione Switch-off agitando delicatamente a 4 °C per 1 giorno, proteggendoli dalla luce con un foglio di alluminio.
  2. Preparare la soluzione di accensione con 1x PBS (pH 7,4) e glutaraldeide fresca all'1% v/v. Mettere tutti i campioni in nuove piastre e incubarli con la soluzione Switch-on con agitazione delicata a 4 °C per 1 giorno, proteggendoli dalla luce con un foglio di alluminio.
    NOTA: A causa dell'elevata tossicità e sensibilità alla luce della glutaraldeide, sia le soluzioni di spegnimento che quelle di accensione devono essere sempre preparate fresche e conservate sotto la cappa chimica su ghiaccio. Riempire sempre il piatto con 20 ml di ciascuna soluzione e sigillarlo con parafilm.

3. Inattivazione e cancellazione

NOTA: La glutaraldeide reattiva nei campioni deve essere inattivata mediante incubazione con una soluzione di inattivazione costituita da 1x PBS pH 7,4, 4% p/v acetammide, 4% p/v glicina, pH 9,0. La soluzione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 3 mesi. Per rimuovere i lipidi e rendere trasparente il tessuto, utilizziamo la soluzione di clearing composta da 200 mM di sodio dodecil solfato (SDS), 20 mM di solfito di sodio (Na2SO3) e 20 mM di acido borico (H3BO3), pH 9,0. La soluzione deve essere conservata a RT poiché la SDS precipita a 4 °C. Tutti i passaggi successivi verranno eseguiti in provette riempite con la soluzione.

  1. Spostare i campioni dalle piastre alle provette e lavare per 3 x 2 ore con 1x PBS pH 7,4 a RT agitando delicatamente.
    NOTA: Per il passaggio 3.1, è necessario lavorare sotto la cappa chimica a causa della tossicità della glutaraldeide. Anche l'acetammide, la SDS e l'acido borico sono reagenti tossici e devono essere maneggiati sotto una cappa chimica. Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione.
  2. Incubare i campioni in soluzione di inattivazione a 37 °C a bagnomaria per una notte (o/n).
  3. Lavare per 3 x 2 ore in 1x PBS pH 7,4 a RT agitando delicatamente.
  4. Incubare i campioni in soluzione di chiarimento a 55 °C a bagnomaria per 3-7 giorni. Cambiare la soluzione ogni 2 giorni (Tabella 1).

4. Immunoetichettatura

NOTA: Prima della fase di etichettatura, è necessario rimuovere la SDS residua, ridurre l'autofluorescenza e smascherare gli epitopi con una soluzione di recupero dell'antigene composta da 10 mM Tris base, 1 mM EDTA e 0,05% v/v Tween 20, pH 9. Il pH della soluzione di 9 è ottimizzato per un processo di recupero efficiente; La base Tris agisce come agente tampone per mantenere un ambiente a pH stabile; L'EDTA, che è un agente chelante, migliora l'accessibilità dell'antigene. Il detergente non ionico Tween 20 aiuta a migliorare la permeabilità del tessuto. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C. È importante notare che il perossido di idrogeno combinato con la fase di recupero dell'antigene ha un effetto sinergico nel ridurre il segnale di autofluorescenza, scomponendo e/o modificando i fluorofori endogeni responsabili del segnale di fondo non specifico (come la lipofuscina).

  1. Preparare 1x PBS con Triton X-100 (PBST) allo 0,1% v/v, preriscaldarlo a 37 °C e lavare i campioni 3 x 3 ore durante il giorno agitando delicatamente a 37 °C nell'incubatore. Lasciare l'ultimo lavaggio o/n.
    NOTA: Conservare la soluzione madre PBST a 4 °C. È fondamentale rimuovere la SDS dal tessuto in quanto può formare precipitati insolubili a basse temperature che possono interferire con i successivi processi di acquisizione.
  2. Il giorno dopo, aggiungere 10 mL di perossido di idrogeno al 30% v/v (H2O2 ) a ciascun campione e lasciarlo agitare delicatamente a RT per 45 minuti.
  3. Lavare 3 x 10 min con 1x PBS (pH 7,4) agitando delicatamente a RT.
  4. Preriscaldare la soluzione di recupero dell'antigene a 95 °C a bagnomaria; trasferire i campioni nella soluzione riscaldata e lasciarli a 95 °C per 10 minuti.
  5. Lasciare raffreddare i campioni a RT per 40 minuti agitando delicatamente.
  6. Lavare 3 x 5 minuti con acqua deionizzata agitando delicatamente.
  7. Equilibrare i campioni in PBS a 4 °C per 15 min.
  8. Preparare una soluzione anticorpale fresca a base di PBST con NaN3 allo 0,01% p/v (vedere la NOTA per il passaggio 1.3) e aggiungere gli anticorpi primari. Incubare i campioni con la soluzione in piastre con coperchio a vite a 37 °C per n giorni (1-7) in un incubatore agitando delicatamente e proteggendo dalla luce (Tabella 2).
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende dalle dimensioni e dallo spessore (Tabella 1 e Tabella 2).
  9. Dopo n giorni, spostare i campioni in provette e lavare 3 x 2 ore con PBST preriscaldato a 37 °C agitando delicatamente nell'incubatore.
  10. Aggiungere gli anticorpi secondari in PBST con NaN3 allo 0,01% p/v e incubare i campioni in nuove piastre con coperchi a vite a 37 °C per n giorni (1-6) in un incubatore agitando delicatamente e al riparo dalla luce (Tabella 1 e Tabella 2).
  11. Dopo n giorni, trasferire i campioni in provette e lavare 3 x 3 ore durante il giorno con PBST preriscaldato a 37 °C in un'incubatrice ad agitazione delicata. Lasciare l'ultimo lavaggio o/n.
    NOTA: Poiché Triton X-100 e Tween 20 sono viscosi, pipettare lentamente per consentire il riempimento del puntale. Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione. Utilizzare 10 mL di soluzioni anticorpali per ogni campione e sigillare la piastra con parafilm per evitare l'evaporazione della soluzione. Poiché le soluzioni anticorpali contengono NaN3, possono essere conservate a 4 °C e riutilizzate per etichettare nuovi campioni entro 2 settimane.

5. Corrispondenza dell'indice di rifrazione

NOTA: Per ottenere un elevato livello di trasparenza, è necessario omogeneizzare l'indice di rifrazione tissutale. Qui usiamo il 2,2'-tiodietanolo (TDE) diluito in 1x PBS. Le soluzioni TDE devono essere conservate in RT.

  1. Trasferire i campioni in nuove stoviglie, aggiungere il 30% v/v TDE e lasciarli per 4 ore agitando delicatamente a RT.
  2. Rimuovere la soluzione di TDE al 30% v/v, aggiungere TDE al 68% v/v ai campioni e lasciarli agitare delicatamente a RT.
    NOTA: Poiché il TDE è viscoso, pipettare lentamente per consentire il riempimento del puntale. L'inalazione di vapore o nebbia TDE può irritare il sistema respiratorio. Pertanto, si consiglia di lavorare in un'area ben ventilata o di utilizzare cappe aspiranti per ridurre al minimo l'esposizione. Le soluzioni TDE devono essere conservate a RT. Utilizzare 10 mL di soluzioni TDE per ciascun campione.

6. Montaggio del campione

NOTA: Per facilitare il montaggio del campione e l'acquisizione dell'immagine LSFM, utilizziamo un portacampioni sigillato su misura (denominato "sandwich"), composto da tre parti: un vetrino da microscopio, un distanziatore e un vetrino coprioggetti.

  1. Posizionare il distanziatore in acciaio (56 x 56 x 0,5 mm3) sul vetrino del microscopio (60 x 60 x 1 mm3) e posizionare il campione sul vetrino per microscopia.
  2. Metti con cura il vetrino coprioggetti al quarzo (60 x 60 x 0,5 mm3), aggancia il tutto insieme e prepara una colla siliconica bicomponente in rapporto 1:1. Utilizzare un vetrino coprioggetti al quarzo per far corrispondere l'indice di rifrazione e ridurre l'aberrazione ottica durante il processo di acquisizione.
  3. Utilizzando una siringa da 1 ml, riempire lo spazio tra il distanziatore e il vetrino coprioggetto con una colla siliconica bicomponente e lasciare asciugare per 10 minuti.
  4. Rimuovere le clip e utilizzare un piccolo ago per riempire lentamente l'intero sandwich con TDE al 68% v/v.
  5. Prepara la colla fresca e sigilla il panino.
    NOTA: Se il TDE raggiunge accidentalmente il distanziatore al punto 6.1, la colla non si indurisce. Assicurarsi che non si formino bolle d'aria durante il passaggio 6.2.

7. Strippaggio

NOTA: La conservazione strutturale e la maggiore accessibilità dell'epitopo di SHORT consentono l'etichettatura multi-round delle fette rimuovendo gli anticorpi e ricolorando i campioni con altri marcatori.

  1. Aprire il panino con una lama, mettere i campioni in nuovi piatti con coperchi a vite riempiti con TDE al 30% v/v e lasciarli per 3 h.
  2. Trasferire i campioni in provette, lavare per 3 x 2 ore in 1x PBS (pH 7,4) a RT con agitazione delicata e lasciare l'ultimo lavaggio o/n.
  3. Porre i campioni in soluzione di chiarimento a bagnomaria a 80 °C per 4 ore.
  4. Lavare per 3 x 2 h in 1x PBST (pH 7,4) a 37 °C agitando delicatamente e lasciare l'ultimo lavaggio. A questo punto il campione è pronto per essere etichettato nuovamente a partire dal passaggio 4.8.
    NOTA: Riempire sempre la provetta con 50 ml di ciascuna soluzione. Utilizzare 10 mL di soluzione TDE per ogni campione.

Risultati

Il protocollo qui descritto consente il trattamento simultaneo di più fette, di spessore variabile da 100 μm a 500 μm, utilizzando il metodo SHORT. Questo approccio riduce significativamente il tempo di elaborazione complessivo per l'intera procedura. In questo lavoro, forniamo una descrizione completa dell'intera pipeline (Figura 1) per l'elaborazione simultanea di più sezioni spesse del cervello umano post-mortem e dimostriamo il protocollo su 24 fette contemporaneamente (

Discussione

L'imaging ad alta risoluzione e la ricostruzione 3D di grandi aree cerebrali umane richiedono il sezionamento meccanico dei tessuti, seguito dalla pulizia ottica e dall'immunomarcatura di singole fette. Il protocollo qui presentato descrive come il metodo di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzato per l'elaborazione rapida e simultanea di più sezioni spesse del cervello umano per la ricostruzione cerebrale 3D con una risoluzione subcellulare con LSFM.

A differenza di altri appro...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Ringraziamo Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Dipartimento di Radiologia, per aver fornito i campioni di cervello umano analizzati in questo studio. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma quadro di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 654148 (Laserlab-Europe), dal programma quadro Horizon 2020 dell'Unione europea per la ricerca e l'innovazione nell'ambito dell'accordo di sovvenzione specifico n. 785907 (Human Brain Project SGA2) e n. 945539 (Human Brain Project SGA3), dal General Hospital Corporation Center del National Institutes of Health con il numero di premio U01 MH117023, e dal Ministero dell'Istruzione nell'ambito di Euro-Bioimaging Italian Node (infrastruttura di ricerca ESFRI). Infine, questa ricerca è stata realizzata con il contributo di "Fondazione CR Firenze". Il contenuto di questo lavoro è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2'-thiodiethanolMerck Life Science S.R.L.166782
Acetamide >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Boric AcidMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateMerck Life Science S.R.L.E5134
GlutaraldehydeMerck Life Science S.R.L.G7651
GlycineSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Hydrogen Peroxide 30%Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075Lab companion /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)//custom-made
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Microscope slidesLaborchimica/customized
Phospate buffer saline tabletMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002out of production
Potassium Hydrogen PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
Sodium AzideMerck Life Science S.R.L.S2002
Sodium Dodecyl SulfateMerck Life Science S.R.L.L3771
Sodium SulfiteMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlcustomized
Sputum Containers (dishes with screw lids)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (ITW reagents)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
TubesSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Water bath MemmertWNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Dilution used, 1:200
Anti-NeuN AntibodyMerck Life Science S.R.L.ABN91Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)Abcamab32895Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)Abcamab8069Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibodyProteinTech12278_1_APDilution used, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbedAbcamab175475Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibodyAbcamab194324Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)ProteinTech16233-1-APDilution used, 1:200

Riferimenti

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