Clarification optique et marquage pour la microscopie à fluorescence à nappe de lumière dans l’imagerie cérébrale humaine à grande échelle

Résumé

Le présent protocole fournit une procédure étape par étape pour l’effacement optique rapide et simultané, le marquage multi-rond et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem en combinant la technique de transformation tissulaire courte (S WITCH - _{H 2}O₂ - Antigène Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]) avec l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuille de lumière dans un protocole de routine à haut débit.

Résumé

Malgré les nombreuses techniques de nettoyage qui ont émergé au cours de la dernière décennie, le traitement des cerveaux humains post-mortem reste une tâche difficile en raison de ses dimensions et de sa complexité, qui rendent l’imagerie à résolution micrométrique particulièrement difficile. Cet article présente un protocole permettant d’effectuer la reconstruction de portions volumétriques du cerveau humain en traitant simultanément des dizaines de coupes avec le protocole de transformation tissulaire SHORT (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]), qui permet l’élimination, le marquage et l’imagerie séquentielle des échantillons par microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM). SHORT permet un nettoyage rapide des tissus et un multi-marquage homogène de tranches épaisses avec plusieurs marqueurs neuronaux, permettant l’identification de différentes sous-populations neuronales dans la matière blanche et grise. Après le déblaiement, les tranches sont imagées via LSFM avec une résolution micrométrique et dans plusieurs canaux simultanément pour une reconstruction 3D rapide. En combinant l’analyse SHORT et LSFM dans le cadre d’un protocole de routine à haut débit, il est possible d’obtenir la reconstruction 3D de la cytoarchitecture de grandes surfaces volumétriques à haute résolution en peu de temps, permettant ainsi une caractérisation structurelle complète du cerveau humain.

Introduction

L’analyse de l’organisation moléculaire 3D et de la cytoarchitecture de grands volumes du cerveau humain nécessite une transparence optique des échantillons, obtenue grâce à des protocoles avec un temps de traitement important. Des techniques de clarification optique ont été développées pour minimiser l’hétérogénéité de l’indice de réfraction (IR) dans les tissus, réduisant ainsi la diffusion de la lumière et augmentant la profondeur de pénétration de la lumière pour l’imagerie haute résolution 1,2,3,4,5. Les progrès actuels dans les méthodes de nettoyage et de marquage des tissus profonds permettent l’imagerie volumétrique d’organes et d’embryons de rongeurs intacts en exploitant des techniques de microscopie^{de pointe} 6,7,8,9,10,11,12.

Cependant, la reconstruction volumétrique 3D de grandes zones du cerveau humain post-mortem représente encore une tâche difficile par rapport aux organismes modèles. La composition biologique complexe et les conditions variables de fixation et de stockage post-mortem peuvent compromettre l’efficacité de l’élimination des tissus, la profondeur de pénétration des anticorps et la reconnaissance des épitopes 13,14,15,16,17,18,19. De plus, la section mécanique des tissus, ainsi que le nettoyage et l’étiquetage ultérieurs de chaque tranche, sont toujours nécessaires pour obtenir un nettoyage efficace et un marquage uniforme de grandes zones du cerveau humain, ce qui entraîne de longs temps de traitement et la nécessité d’un équipement personnalisé sophistiqué, par rapport aux organismes modèles 15,20,21,22.

La technique de transformation tissulaire S WITCH - H₂O₂ - antigène Retrieval -TDE (SHORT) a été développée spécifiquement pour analyser de grands volumes du cerveau humain^18,23. Cette méthode utilise la préservation structurelle tissulaire du protocole SWITCH¹¹ et des concentrations élevées de peroxyde d’hydrogène pour diminuer l’autofluorescence tissulaire, en combinaison avec la restauration d’épitopes. SHORT permet une coloration uniforme des tranches de cerveau humain avec des marqueurs pour différents sous-types neuronaux, cellules gliales, vascularisation et fibres myélinisées^18,24. Ses résultats sont compatibles avec l’analyse des protéines de basse et de haute densité. Les niveaux élevés de transparence et l’uniformité du marquage qui en résultent permettent la reconstruction volumétrique de tranches épaisses par microscopie à fluorescence, en particulier pour l’acquisition rapide d’appareils à nappe de lumière pouvant être utilisés 18,24,25,26,27.

Dans ce travail, nous décrivons comment la technique de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le nettoyage simultané et le marquage multi-tours de dizaines de sections de cerveau humain fixées au formol. Quatre marqueurs fluorescents différents peuvent être utilisés ensemble, ce qui permet d’identifier différentes sous-populations cellulaires. Après le nettoyage, l’imagerie volumétrique à haute résolution peut être réalisée par microscopie à fluorescence. Ici, nous avons utilisé un LSFM inversé 18,24,25,26,27 sur mesure, qui permet une coupe optique rapide de l’échantillon et une acquisition rapide de plusieurs canaux en parallèle. Avec ce protocole à haut débit de routine, il est possible d’obtenir une caractérisation cellulaire et structurale complète avec une résolution subcellulaire de grandes zones du cerveau humain, comme cela a déjà été démontré dans la cartographie de l’ensemble de l’aire de Broca²³.

Protocole

Des échantillons de tissus humains fixés au formol ont été fournis par le département de neuropathologie du service d’autopsie du Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, États-Unis). Le consentement écrit des participants en bonne santé a été obtenu avant leur décès, conformément aux protocoles de prélèvement de tissus approuvés par la CISR et établis par le Comité de biosécurité de l’établissement des partenaires (PIBC, protocole 2003P001937). Les documents d’autorisation sont conservés auprès des services d’autopsie de l’HGM à Boston, MA, États-Unis, et sont disponibles sur demande.

1. Enrobage d’agarose et découpe d’échantillons

1. Préparez une solution d’agarose à 4 % p/v dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) dans un bécher et insérez le bloc de tissu à l’intérieur. Attendez qu’il atteigne la température ambiante (RT), puis conservez-le à 4 °C pendant 24 h.
2. Pour obtenir des coupes de haute précision, collez l’échantillon sur le disque d’échantillon du vibratome et remplissez le plateau avec 1x PBS froid (pH 7,4). Ajustez les paramètres du vibratome tels que la fréquence, l’amplitude et la vitesse en fonction du type de tissu à trancher (valeurs utilisées : fréquence = 5 (50 Hz) ; amplitude = 0,4 ; vitesse = 3 (0,15 mm/s).
   REMARQUE : Différents vibratomes doivent être utilisés en fonction du volume de l’échantillon. Pour les échantillons d’un volume maximal de 70 x 40 x 15 mm, un vibratome (par exemple, Leica VT1000 S) peut être utilisé ; pour les échantillons plus volumineux, il est possible d’utiliser un compresstome (par exemple, le microtome VF-900-0Z¹⁸) ou un appareil sur mesure²¹. Nous présentons ici des tranches découpées d’une épaisseur de 400 μm ou 500 μm.
3. Après la coupe, mettez toutes les tranches dans une solution de conservation composée de 1x PBS (pH 7,4) avec 0,01% p/v d’azoture de sodium (NaN₃) et conservez à 4 °C.
   REMARQUE : Avant d’enrober, attendez que la solution d’agarose atteigne 37 °C. Une température plus élevée pourrait endommager l’échantillon. Il est recommandé de ne pas laisser les échantillons dans la PFA pendant plus de 48 h car une fixation prolongée pourrait interférer avec la procédure de marquage en endommageant les antigènes et en augmentant l’autofluorescence des tissus. Pour le stockage à long terme des tissus humains, le PBS avec NaN₃ est utilisé pour prévenir la contamination microbienne. En raison de la toxicité du NaN₃, préparez la solution de conservateur sous une hotte chimique.

2. Fixation tissulaire

REMARQUE : Toutes les solutions utilisées dans le protocole suivant sont préparées en grands volumes, suffisants pour traiter toutes les tranches d’un même bloc de tissu et minimiser la variabilité technique et réduire le temps pour les étapes individuelles.

1. Préparez la solution d’arrêt avec 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M d’acide chlorhydrique (HCl), 25 % v/v 0,1 M d’hydrogénophtalate de potassium (KHP) et du glutaraldéhyde frais 4 % v/v. Placez tous les échantillons dans des boîtes avec des couvercles à vis (70 x 23 mm) et incubez-les avec la solution Switch-off en agitant doucement à 4 °C pendant 1 jour, en les protégeant de la lumière avec du papier d’aluminium.
2. Préparez la solution Switch-on avec 1x PBS (pH 7,4) et du glutaraldéhyde frais à 1% v/v. Placez tous les échantillons dans de nouvelles boîtes et incubez-les avec la solution Switch-on en agitant doucement à 4 °C pendant 1 jour, en les protégeant de la lumière avec du papier d’aluminium.
   REMARQUE : En raison de la toxicité élevée et de la sensibilité à la lumière du glutaraldéhyde, les solutions d’arrêt et d’allumage doivent toujours être préparées fraîches et conservées sous la hotte chimique sur de la glace. Remplissez toujours le plat avec 20 mL de chaque solution et scellez-le avec du parafilm.

3. Inactivation et effacement

REMARQUE : Le glutaraldéhyde réactif dans les échantillons doit être inactivé par incubation avec une solution d’inactivation composée de 1x PBS pH 7,4, 4% p/v d’acétamide, 4% p/v de glycine, pH 9,0. La solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à 3 mois. Pour éliminer les lipides et rendre le tissu transparent, nous utilisons la solution de clarification composée de 200 mM de dodécylsulfate de sodium (SDS), de 20 mM de sulfite de sodium (Na₂SO₃) et de 20 mM d’acide borique (H₃BO₃), pH 9,0. La solution doit être stockée à RT car le SDS précipite à 4 °C. Toutes les étapes suivantes seront effectuées dans des tubes remplis de la solution.

1. Déplacez les échantillons de la vaisselle vers les tubes et lavez-les pendant 3 x 2 h avec 1x PBS pH 7,4 à RT en agitant doucement.
   REMARQUE : Pour l’étape 3.1, il est nécessaire de travailler sous la hotte chimique en raison de la toxicité du glutaraldéhyde. L’acétamide, le SDS et l’acide borique sont également des réactifs toxiques et doivent être manipulés sous une hotte chimique. Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution.
2. Incuber les échantillons dans une solution d’inactivation à 37 °C au bain-marie pendant une nuit (o/n).
3. Laver pendant 3 x 2 h dans 1x PBS pH 7,4 à RT en agitant doucement.
4. Incuber les échantillons dans une solution claire à 55 °C au bain-marie pendant 3 à 7 jours. Changez la solution tous les 2 jours (tableau 1).

4. Immunomarquage

REMARQUE : Avant l’étape de marquage, il est nécessaire d’enlever la FDS résiduelle, de réduire l’autofluorescence et de démasquer les épitopes avec une solution de récupération d’antigène composée de 10 mM de base Tris, 1 mM d’EDTA et 0,05 % v/v Tween 20, pH 9. Le pH de la solution de 9 est optimisé pour un processus de récupération efficace ; La base Tris agit comme un agent tampon pour maintenir un environnement de pH stable ; L’EDTA, qui est un agent chélateur, améliore l’accessibilité de l’antigène. Le détergent non ionique Tween 20 aide à améliorer la perméabilité des tissus. Cette solution peut être conservée à 4 °C. Il est important de noter que le peroxyde d’hydrogène combiné à l’étape de récupération de l’antigène ont un effet synergique dans la réduction du signal d’autofluorescence, en décomposant et/ou en modifiant les fluorophores endogènes responsables du signal de fond non spécifique (comme la lipofuscine).

1. Préparez 1x PBS avec 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), préchauffez-le à 37 °C et lavez les échantillons 3 x 3 h pendant la journée en agitant doucement à 37 °C dans l’incubateur. Laissez le dernier lavage o/n.
   REMARQUE : Conserver la solution mère PBST à 4 °C. Il est crucial d’éliminer le SDS du tissu car il peut former des précipités insolubles à basse température qui peuvent interférer avec les processus d’acquisition ultérieurs.
2. Le lendemain, ajoutez 10 mL de peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) à 30 % v/v à chaque échantillon et laissez-le agiter doucement à RT pendant 45 min.
3. Laver 3 x 10 min avec 1x PBS (pH 7,4) en agitant doucement à RT.
4. Préchauffer la solution de récupération d’antigène à 95 °C au bain-marie ; transférer les échantillons dans la solution chauffée et les laisser à 95 °C pendant 10 min.
5. Laisser refroidir les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient RT pendant 40 minutes en agitant doucement.
6. Laver 3 x 5 min avec de l’eau déminéralisée en agitant doucement.
7. Équilibrer les échantillons dans du PBS à 4 °C pendant 15 min.
8. Préparer une nouvelle solution d’anticorps à base de PBST avec 0,01 % p/v de NaN₃ (voir la NOTE pour l’étape 1.3) et ajouter les anticorps primaires. Incuber les échantillons avec la solution dans des boîtes à couvercle à vis à 37 °C pendant n jours (1-7) dans un incubateur en agitant doucement et à l’abri de la lumière (tableau 2).
   REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la taille et de l’épaisseur (tableau 1 et tableau 2).
9. Après n jours, déplacer les échantillons dans des tubes et laver 3 x 2 h avec du PBST préchauffé à 37 °C en agitant doucement dans l’incubateur.
10. Ajouter des anticorps secondaires dans du PBST contenant 0,01 % p/v de NaN₃ et incuber les échantillons dans de nouvelles boîtes avec des couvercles à vis à 37 °C pendant n jours (1-6) dans un incubateur en agitant doucement et à l’abri de la lumière (Tableaux 1 et 2).
11. Après n jours, transférer les échantillons dans des tubes et les laver 3 x 3 h pendant la journée avec du PBST préchauffé à 37 °C dans un incubateur à agitation douce. Laissez le dernier lavage o/n.
    REMARQUE : Comme Triton X-100 et Tween 20 sont visqueux, pipetez lentement pour permettre à l’embout de se remplir. Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution. Utilisez 10 mL de solutions d’anticorps pour chaque échantillon et scellez la boîte avec un parafilm pour empêcher l’évaporation de la solution. Étant donné que les solutions d’anticorps contiennent du NaN_3, elles peuvent être stockées à 4 °C et réutilisées pour marquer de nouveaux échantillons dans un délai de 2 semaines.

5. Correspondance de l’indice de réfraction

REMARQUE : Pour obtenir un haut niveau de transparence, il est nécessaire d’homogénéiser l’indice de réfraction tissulaire. Ici, nous utilisons du 2,2'-thiodiéthanol (TDE) dilué dans 1x PBS. Les solutions TDE doivent être stockées à RT.

1. Transférez les échantillons dans de nouveaux plats, ajoutez 30 % v/v de TDE et laissez-les pendant 4 h en agitant doucement à RT.
2. Retirez la solution de TDE à 30 % v/v, ajoutez 68 % de TDE v/v aux échantillons et laissez-les en agitant doucement à RT.
   REMARQUE : Comme le TDE est visqueux, pipetez lentement pour permettre à l’embout de se remplir. L’inhalation de vapeur ou de brouillard de TDE peut irriter le système respiratoire. Par conséquent, il est conseillé de travailler dans un endroit bien ventilé ou d’utiliser des hottes pour minimiser l’exposition. Les solutions de TDE doivent être entreposées à RT. Utiliser 10 mL de solutions de TDE pour chaque échantillon.

6. Montage de l’échantillon

REMARQUE : Pour faciliter le montage de l’échantillon et l’acquisition d’images LSFM, nous utilisons un porte-échantillon scellé sur mesure (appelé « sandwich »), qui se compose de trois parties : une lame de microscope, une entretoise et une lamelle.

1. Placez l’entretoise en acier (56 x 56 x 0,5 mm³) sur la lame de microscope (60 x 60 x 1 mm³) et posez l’échantillon sur la lame de microscopie.
2. Mettez soigneusement la lamelle de quartz (60 x 60 x 0,5 mm³), clipsez le tout ensemble et préparez une colle au silicone à deux composants dans un rapport de 1 :1. Utilisez une lamelle de quartz pour faire correspondre l’indice de réfraction et réduire l’aberration optique pendant le processus d’acquisition.
3. À l’aide d’une seringue de 1 ml, remplissez l’espace entre l’entretoise et la lamelle avec une colle silicone à deux composants et laissez sécher pendant 10 min.
4. Retirez les pinces et utilisez une petite aiguille pour remplir lentement tout le sandwich avec 68 % v/v TDE.
5. Préparez de la colle fraîche et scellez le sandwich.
   REMARQUE : Si le TDE atteint accidentellement l’entretoise à l’étape 6.1, la colle ne durcira pas. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne se forme à l’étape 6.2.

7. Décapage

REMARQUE : La préservation structurelle et l’accessibilité améliorée des épitopes de SHORT permettent un marquage multi-tours des tranches en retirant les anticorps et en recolorant les échantillons avec d’autres marqueurs.

1. Ouvrez le sandwich à l’aide d’une lame, mettez les spécimens dans des plats neufs avec des couvercles à vis remplis de TDE à 30% v/v, et laissez-les pendant 3 h.
2. Transférez les échantillons dans des tubes, lavez-les pendant 3 x 2 h dans 1x PBS (pH 7,4) à RT en agitant doucement et laissez le dernier lavage o/n.
3. Placer les échantillons dans une solution claire au bain-marie à 80 °C pendant 4 h.
4. Laver pendant 3 x 2 h dans 1x PBST (pH 7,4) à 37 °C en agitant doucement et laisser le dernier lavage o/n. L’échantillon est maintenant prêt à être étiqueté à nouveau à partir de l’étape 4.8.
   REMARQUE : Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution. Utiliser 10 mL de solution de TDE pour chaque échantillon.

Résultats

Le protocole décrit ici permet le traitement simultané de plusieurs tranches, d’une épaisseur allant de 100 μm à 500 μm, en utilisant la méthode SHORT. Cette approche réduit considérablement le temps de traitement global de l’ensemble de la procédure. Dans ce travail, nous fournissons une description complète de l’ensemble du pipeline (Figure 1) pour le traitement simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain post-mortem et nous démontrons le protocole sur 24 c...

Discussion

L’imagerie à haute résolution et la reconstruction 3D de grandes zones du cerveau humain nécessitent une coupe mécanique des tissus, suivie d’un nettoyage optique et d’un immunomarquage de tranches individuelles. Le protocole présenté ici décrit comment la méthode de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le traitement rapide et simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain pour la reconstruction cérébrale 3D avec une résolution subcellulaire avec LSFM.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200