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Clarification optique et marquage pour la microscopie à fluorescence à nappe de lumière dans l’imagerie cérébrale humaine à grande échelle
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Dans cet article
Résumé
Le présent protocole fournit une procédure étape par étape pour l’effacement optique rapide et simultané, le marquage multi-rond et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem en combinant la technique de transformation tissulaire courte (S WITCH - H 2O2 - Antigène Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]) avec l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuille de lumière dans un protocole de routine à haut débit.
Résumé
Malgré les nombreuses techniques de nettoyage qui ont émergé au cours de la dernière décennie, le traitement des cerveaux humains post-mortem reste une tâche difficile en raison de ses dimensions et de sa complexité, qui rendent l’imagerie à résolution micrométrique particulièrement difficile. Cet article présente un protocole permettant d’effectuer la reconstruction de portions volumétriques du cerveau humain en traitant simultanément des dizaines de coupes avec le protocole de transformation tissulaire SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]), qui permet l’élimination, le marquage et l’imagerie séquentielle des échantillons par microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM). SHORT permet un nettoyage rapide des tissus et un multi-marquage homogène de tranches épaisses avec plusieurs marqueurs neuronaux, permettant l’identification de différentes sous-populations neuronales dans la matière blanche et grise. Après le déblaiement, les tranches sont imagées via LSFM avec une résolution micrométrique et dans plusieurs canaux simultanément pour une reconstruction 3D rapide. En combinant l’analyse SHORT et LSFM dans le cadre d’un protocole de routine à haut débit, il est possible d’obtenir la reconstruction 3D de la cytoarchitecture de grandes surfaces volumétriques à haute résolution en peu de temps, permettant ainsi une caractérisation structurelle complète du cerveau humain.
Introduction
L’analyse de l’organisation moléculaire 3D et de la cytoarchitecture de grands volumes du cerveau humain nécessite une transparence optique des échantillons, obtenue grâce à des protocoles avec un temps de traitement important. Des techniques de clarification optique ont été développées pour minimiser l’hétérogénéité de l’indice de réfraction (IR) dans les tissus, réduisant ainsi la diffusion de la lumière et augmentant la profondeur de pénétration de la lumière pour l’imagerie haute résolution 1,2,3,4,5. L....
Protocole
Des échantillons de tissus humains fixés au formol ont été fournis par le département de neuropathologie du service d’autopsie du Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, États-Unis). Le consentement écrit des participants en bonne santé a été obtenu avant leur décès, conformément aux protocoles de prélèvement de tissus approuvés par la CISR et établis par le Comité de biosécurité de l’établissement des partenaires (PIBC, protocole 2003P001937). Les documents d’autorisation sont conservés auprès des services d’autopsie de l’HGM à Boston, MA, États-Unis, et sont disponibles sur demande.
1. Enrobage d’agarose et découpe d’échantill....
Résultats Représentatifs
Le protocole décrit ici permet le traitement simultané de plusieurs tranches, d’une épaisseur allant de 100 μm à 500 μm, en utilisant la méthode SHORT. Cette approche réduit considérablement le temps de traitement global de l’ensemble de la procédure. Dans ce travail, nous fournissons une description complète de l’ensemble du pipeline (Figure 1) pour le traitement simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain post-mortem et nous démontrons le protocole sur 24 c.......
Discussion
L’imagerie à haute résolution et la reconstruction 3D de grandes zones du cerveau humain nécessitent une coupe mécanique des tissus, suivie d’un nettoyage optique et d’un immunomarquage de tranches individuelles. Le protocole présenté ici décrit comment la méthode de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le traitement rapide et simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain pour la reconstruction cérébrale 3D avec une résolution subcellulaire avec LSFM.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Remerciements
Nous remercions Bruce Fischl, du Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, d’avoir fourni les échantillons de cerveau humain analysés dans le cadre de cette étude. Ce projet a reçu un financement du programme-cadre de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 654148 (Laserlab-Europe), du programme-cadre Horizon 2020 de l’Union européenne pour la recherche et l’innovation dans le cadre de l’accord de subvention spécifique n° 785907 (Human Brain Project SGA2) et n° 945539 (Human Brain Project SGA3), du General Hospital Corporation Center des Nat....
matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
Références
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing.
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