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요약

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

초록

지난 10년 동안 등장한 수많은 클리어링 기술에도 불구하고 사후 인간 뇌를 처리하는 것은 크기와 복잡성으로 인해 마이크로미터 해상도의 이미징을 특히 어렵게 만드는 어려운 작업으로 남아 있습니다. 이 논문은 광시트 형광 현미경(LSFM)으로 샘플의 투명화, 라벨링 및 순차 이미징을 가능하게 하는 SHORT(SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) 조직 형질 전환 프로토콜로 수십 개의 섹션을 동시에 처리하여 인간 뇌의 체적 부분을 재구성하는 프로토콜을 제시합니다. SHORT는 여러 신경 세포 마커가 있는 두꺼운 절편의 신속한 조직 투명화 및 균질한 다중 표지를 제공하여 백질 및 회백질 모두에서 다양한 신경 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 클리어링 후 슬라이스는 LSFM을 통해 마이크로미터 해상도로 여러 채널에서 동시에 이미징되어 신속한 3D 재구성이 가능합니다. 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜 내에서 SHORT와 LSFM 분석을 결합함으로써 짧은 시간에 고해상도로 큰 부피 영역의 3D 세포 구조 재구성을 얻을 수 있으므로 인간 뇌의 포괄적인 구조적 특성 분석이 가능합니다.

서문

대량의 인간 뇌의 3D 분자 조직과 세포 구조를 분석하려면 광범위한 처리 시간이 소요되는 프로토콜을 통해 표본의 광학적 투명성이 필요합니다. 광학 투명화 기술은 조직 내 굴절률(RI)의 이질성을 최소화하여 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 위한 광 투과 깊이를 증가시키기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4,5. 투명화 및 심층 조직 표지 방법의 현재 발전은 최첨단 현미경 기술 6,7,8,9,10,11,12 을 활용하여 온전한 설치류 장기 및 배아의 체적 이미징을 가능하게 합니다.

그러나 사후 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 체적 3D 재구성은 모델 유기체에 비해 여전히 어려운 작업입니다. 복잡한 생물학적 조성과 가변적인 사후 고정 및 보관 조건은 조직 투명화 효율, 항체 침투 깊이 및 항원결정기 인식을 손상시킬 수 있습니다 13,14,15,16,17,18,19. 더욱이, 큰 인간 뇌 영역의 효율적인 투명화 및 균일한 표지를 달성하기 위해서는 기계적 조직 절편과 각 절편의 후속 투명화 및 표지가 여전히 필요하며, 그 결과 모델 유기체에 비해 처리 시간이 길고 정교한 맞춤형 장비가 필요합니다 15,20,21,22.

SWITCH - H 2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) 조직 형질전환 기술은 인간 뇌18,23의 많은 양을 분석하기 위해 특별히 개발되었다. 이 방법은 에피토프 복원과 함께 SWITCH 프로토콜11의 조직 구조 보존과 고농도의 과산화수소를 사용하여 조직 자가형광을 감소시킵니다. SHORT는 다양한 신경 아형, 신경교세포, 혈관 및 수초화 섬유에 대한 마커를 사용하여 인간 뇌 절편의 균일한 염색을 허용합니다18,24. 그 결과는 저밀도 및 고밀도 단백질의 분석과 모두 호환됩니다. 그 결과 높은 투명도 수준과 균일한 라벨링은 형광 현미경으로 두꺼운 슬라이스의 체적 재구성을 가능하게 하며, 특히 빠른 획득을 위해 광시트 장치를 사용할 수 있습니다 18,24,25,26,27.

이 연구에서는 SHORT 조직 형질전환 기법을 사용하여 수십 개의 포르말린 고정 인간 뇌 절편을 동시에 투명화하고 다중으로 표지하는 방법을 설명합니다. 4개의 서로 다른 형광 마커를 함께 사용할 수 있어 서로 다른 세포 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 투명화 후 형광 현미경으로 고해상도 체적 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기서는 맞춤형 도립 LSFM 18,24,25,26,27을 사용하여 샘플의 빠른 광학 절편과 여러 채널을 병렬로 빠르게 수집할 수 있습니다. 이러한 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜을 사용하여, 전체 Broca의 영역(23)의 매핑에서 이미 입증된 바와 같이 인간 뇌의 넓은 영역에 대한 세포 내 분해능으로 포괄적인 세포 및 구조적 특성 분석을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

포르말린 고정 인체 조직 샘플은 매사추세츠 종합병원(MGH) 부검 서비스(미국 보스턴)의 신경병리학과에서 제공하였다. 서면 동의는 Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC, 프로토콜 2003P001937)의 IRB 승인 조직 수집 프로토콜에 따라 사망 전에 건강한 참가자로부터 얻었습니다. 승인 문서는 미국 매사추세츠주 보스턴에 있는 MGH 부검 서비스에 보관되며 요청 시 제공됩니다.

1. 아가로스 임베딩 및 시료 절단

  1. 비커에 4x 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 1% w/v 아가로스 용액을 준비하고 내부에 조직 블록을 삽입합니다. 실온(RT)에 도달할 때까지 기다렸다가 4°C에서 24시간 동안 보관합니다.
  2. 고정밀 절편을 얻으려면 샘플을 비브라톰의 시편 디스크에 붙이고 트레이를 차가운 1x PBS(pH 7.4)로 채웁니다. 슬라이스할 조직의 유형에 따라 주파수, 진폭 및 속도와 같은 진동 매개변수를 조정합니다(사용된 값: 주파수 = 5(50Hz), 진폭 = 0.4, 속도 = 3(0.15mm/s).
    알림: 샘플 볼륨에 따라 다른 진동을 사용해야 합니다. 최대 부피가 70 x 40 x 15 mm인 샘플의 경우 진동체(예: Leica VT1000 S)를 사용할 수 있습니다. 더 큰 샘플의 경우, 압축체(예를 들어, VF-900-0Z 마이크로톰(18)) 또는 주문형 장치(21)를 사용할 수 있다. 여기에서는 400μm 또는 500μm 두께로 절단된 슬라이스를 제공합니다.
  3. 절단 후 모든 슬라이스를 1x PBS(pH 7.4)와 0.01% w/v 아지드화나트륨(NaN3)으로 구성된 보존제 용액에 넣고 4°C에서 보관합니다.
    알림: 삽입하기 전에 아가로스 용액이 37°C에 도달할 때까지 기다리십시오. 온도가 높으면 시편이 손상될 수 있습니다. 장기간 고정하면 항원이 손상되고 조직 자가형광이 증가하여 라벨링 절차를 방해할 수 있으므로 샘플을 PFA에 48시간 이상 방치하지 않는 것이 좋습니다. 인체 조직의 장기 보관을 위해 NaN3 가 함유 된 PBS를 사용하여 미생물 오염을 방지합니다. NaN3 의 독성으로 인해 화학 후드 아래에서 보존제 용액을 준비하십시오.

2. 조직 고정

참고: 다음 프로토콜에 사용된 모든 용액은 동일한 조직 블록의 모든 슬라이스를 처리하고 기술적 변동성을 최소화하며 개별 단계의 시간을 줄이기에 충분한 대량으로 준비됩니다.

  1. 50% v/v 1x PBS pH 3, 25% v/v 0.1M 염산(HCl), 25% v/v 0.1M 칼륨 수소 프탈레이트(KHP) 및 신선한 4% v/v 글루타르알데히드로 스위치 끄기 용액을 준비합니다. 모든 샘플을 나사 뚜껑(70 x 23mm)이 있는 접시에 넣고 4°C에서 1일 동안 부드럽게 흔들어 스위치 끄기 용액으로 배양하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호합니다.
  2. 1x PBS(pH 7.4)와 신선한 1% v/v 글루타르알데히드로 스위치 온 용액을 준비합니다. 모든 샘플을 새 접시에 넣고 4°C에서 1일 동안 부드럽게 흔들면서 스위치 온 용액으로 배양하고 알루미늄 호일로 빛으로부터 보호합니다.
    알림: 글루타르알데히드의 높은 독성과 빛에 민감하기 때문에 스위치 오프 및 스위치 온 용액은 항상 신선하게 준비해야 하며 얼음 위의 화학 후드 아래에 보관해야 합니다. 항상 접시에 각 용액 20mL를 채우고 파라필름으로 밀봉합니다.

3. 비활성화 및 지우기

참고: 샘플의 반응성 글루타르알데히드는 1x PBS pH 7.4, 4% w/v 아세트아미드, 4% w/v 글리신, pH 9.0으로 구성된 불활성화 용액으로 배양하여 비활성화해야 합니다. 용액은 4°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다. 지질을 제거하고 조직을 투명하게 만들기 위해 200mM 도데실 설페이트(SDS), 20mM 아황산나트륨(Na2SO3) 및 20mM 붕산(H3BO3), pH 9.0으로 구성된 투명화 용액을 사용합니다. 용액은 SDS가 4°C에서 침전되므로 RT에 보관해야 합니다. 다음 단계는 모두 용액으로 채워진 튜브에서 수행됩니다.

  1. 샘플을 접시에서 튜브로 옮기고 RT에서 1x PBS pH 7.4로 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다.
    알림: 3.1단계의 경우 글루타르알데히드 독성 때문에 화학 후드 아래에서 작업해야 합니다. 아세트아미드, SDS 및 붕산도 독성 시약이므로 화학 후드 아래에서 취급해야 합니다. 항상 각 용액 50mL를 튜브에 채웁니다.
  2. 샘플을 37°C의 불활화 용액에 넣고 수조에서 밤새 배양합니다(o/n).
  3. RT에서 1x PBS pH 7.4에서 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다.
  4. 샘플을 55°C의 세척액에서 3-7일 동안 수조에서 배양합니다. 2일마다 용액을 교체하십시오(표 1).

4. 면역표지

참고: 라벨링 단계 전에 잔류 SDS를 제거하고, 자가형광을 줄이고, 10mM Tris 염기, 1mM EDTA 및 0.05% v/v 트윈 20, pH 9로 구성된 항원 회수 용액으로 에피토프를 가림을 해제해야 합니다. 용액의 pH 9는 효율적인 회수 공정에 최적화되어 있습니다. 트리스 베이스는 안정적인 pH 환경을 유지하기 위한 완충제 역할을 합니다. 킬레이트제인 EDTA는 항원의 접근성을 향상시킵니다. 비이온성 세제 Tween 20은 조직의 투과성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 이 용액은 4°C에서 보관할 수 있습니다. 항원 회수 단계와 결합된 과산화수소는 비특이적 배경 신호(예: 리포푸신)를 담당하는 내인성 형광단을 분해 및/또는 변형하여 자가형광 신호를 감소시키는 데 시너지 효과를 갖는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

  1. 0.1% v/v Triton X-100(PBST)으로 PBS 1개를 준비하고 37°C로 예열한 다음 인큐베이터에서 37°C에서 부드럽게 흔들면서 낮 동안 3 x 3시간 동안 샘플을 세척합니다. 마지막 세탁 o/n은 그대로 두십시오.
    알림: PBST 원액을 4°C에서 보관하십시오. SDS는 후속 취득 과정을 방해할 수 있는 저온에서 불용성 침전물을 형성할 수 있으므로 조직에서 제거하는 것이 중요합니다.
  2. 다음날 각 샘플에 30% v/v 과산화수소(H2O2) 10mL를 넣고 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들어 둡니다.
  3. 1x PBS(pH 7.4)로 3 x 10분 동안 RT에서 부드럽게 흔들어 세척합니다.
  4. 항원 회수 용액을 수조에서 95°C로 예열합니다. 샘플을 가열된 용액으로 옮기고 95°C에서 10분 동안 그대로 둡니다.
  5. 표본을 부드럽게 흔들면서 40분 동안 RT로 식히십시오.
  6. 3 x 5 분 동안 탈 이온수로 부드럽게 흔들어 씻으십시오.
  7. PBS에서 4°C에서 15분 동안 평형을 유지합니다.
  8. 0.01% w/vNaN3 (1.3단계 참고 참조)의 PBST로 만든 새로운 항체 용액을 준비하고 1차 항체를 추가합니다. 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호하는 인큐베이터에서 37°C에서 n일(1-7) 동안 스크류 뚜껑이 있는 접시에 용액과 함께 샘플을 배양합니다(표 2).
    참고: 배양 시간은 크기와 두께에 따라 다릅니다(표 1 및 표 2).
  9. n일 후 샘플을 튜브로 옮기고 인큐베이터에서 부드럽게 흔들면서 37°C에서 예열된 PBST로 3 x 2시간 세척합니다.
  10. 0.01% w/vNaN3 의 PBST에 2차 항체를 추가하고 부드럽게 흔들고 빛으로부터 보호되는 인큐베이터에서 n일 동안 37°C(1-6)의 나사 뚜껑이 있는 새 접시에 샘플을 배양합니다(표 1 및 표 2).
  11. n일 후 샘플을 튜브로 옮기고 부드럽게 흔드는 인큐베이터에서 37°C에서 예열된 PBST로 낮 동안 3 x 3시간 동안 세척합니다. 마지막 세탁 o/n은 그대로 두십시오.
    참고: Triton X-100 및 Tween 20은 점성이 있으므로 팁이 채워질 수 있도록 천천히 피펫팅합니다. 항상 각 용액 50mL를 튜브에 채웁니다. 각 샘플에 대해 10mL의 항체 용액을 사용하고 용액의 증발을 방지하기 위해 파라필름으로 접시를 밀봉합니다. 항체 용액에는 NaN3 가 포함되어 있기 때문에 4 °C에서 보관하고 2 주 이내에 새 검체를 라벨링하는 데 재사용할 수 있습니다.

5. 굴절률 매칭

알림: 높은 수준의 투명도를 얻으려면 조직 굴절률을 균질화해야 합니다. 여기서는 1x PBS에 희석된 2,2'-티오디에탄올(TDE)을 사용합니다. TDE 솔루션은 RT에 저장해야 합니다.

  1. 샘플을 새 접시로 옮기고 30% v/v TDE를 추가한 다음 RT에서 부드럽게 흔들면서 4시간 동안 그대로 둡니다.
  2. 30% v/v TDE 용액을 제거하고 샘플에 68% v/v TDE를 추가한 다음 RT에서 부드럽게 흔들어 둡니다.
    알림: TDE는 점성이 있으므로 팁이 채워질 수 있도록 천천히 피펫팅합니다. TDE 증기 또는 미스트 흡입은 호흡기를 자극할 수 있습니다. 따라서 환기가 잘 되는 곳에서 작업하거나 흄 후드를 사용하여 노출을 최소화하는 것이 좋습니다. TDE 용액은 RT에 보관해야 합니다. 각 샘플에 대해 10mL의 TDE 용액을 사용합니다.

6. 샘플 장착

참고: 샘플 장착 및 LSFM 이미지 획득을 용이하게 하기 위해 현미경 슬라이드, 스페이서 및 커버슬립의 세 부분으로 구성된 맞춤형 밀봉된 샘플 홀더("샌드위치"라고 함)를 사용합니다.

  1. 강철 스페이서(56 x 56 x 0.5mm3)를 현미경 슬라이드(60 x 60 x 1mm3) 위에 놓고 샘플을 현미경 슬라이드에 놓습니다.
  2. 석영 커버슬립(60 x 60 x 0.5mm3)을 조심스럽게 넣고 모든 것을 함께 클립으로 고정하고 1:1 비율로 2액형 실리콘 접착제를 준비합니다. 석영 커버슬립을 사용하여 굴절률을 일치시키고 획득 과정에서 광학 수차를 줄입니다.
  3. 1mL 주사기를 사용하여 스페이서와 커버슬립 사이의 공간을 2액형 실리콘 접착제로 채우고 10분 동안 건조시킵니다.
  4. 클립을 제거하고 작은 바늘을 사용하여 샌드위치 전체를 68% v/v TDE로 천천히 채웁니다.
  5. 신선한 접착제를 만들고 샌드위치를 밀봉하십시오.
    알림: TDE가 6.1단계에서 실수로 스페이서에 도달하면 접착제가 경화되지 않습니다. 6.2단계에서 기포가 형성되지 않도록 하십시오.

7. 스트리핑

참고: SHORT의 구조적 보존과 향상된 에피토프 접근성은 항체를 제거하고 다른 마커로 샘플을 다시 염색하여 절편의 다중 라운드 라벨링을 가능하게 합니다.

  1. 칼날로 샌드위치를 열고 30% v/v TDE로 채워진 나사 뚜껑이 있는 새 접시에 표본을 넣고 3시간 동안 그대로 둡니다.
  2. 샘플을 튜브로 옮기고 RT에서 1x PBS(pH 7.4)에서 부드럽게 흔들어 3 x 2시간 동안 세척한 다음 마지막 세척 o/n을 그대로 둡니다.
  3. 샘플을 80°C의 수조에서 4시간 동안 세척액에 넣습니다.
  4. 37°C에서 1x PBST(pH 7.4)에서 3 x 2시간 동안 부드럽게 흔들어 세척하고 마지막 세척 o/n을 그대로 둡니다. 이제 4.8단계부터 샘플에 다시 레이블을 지정할 준비가 되었습니다.
    알림: 항상 튜브에 각 용액 50mL를 채우십시오. 각 샘플에 10mL의 TDE 용액을 사용합니다.

결과

여기에 설명된 프로토콜은 SHORT 방법을 사용하여 두께가 100μm에서 500μm에 이르는 여러 슬라이스를 동시에 처리할 수 있습니다. 이 접근 방식은 전체 절차의 전체 처리 시간을 크게 줄입니다. 이 작업에서는 여러 사후 인간 뇌 두께 절편을 동시에 처리하기 위한 전체 파이프라인(그림 1)에 대한 포괄적인 설명을 제공하고 한 번에 24개 슬라이스에 대한 프로토콜을 시연합니다(<...

토론

인간의 큰 뇌 부위를 고분해능 이미징 및 3D로 재구성하려면 기계적 조직 절편에 이어 광학 투명화 및 단일 절편의 면역 표지가 필요합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 LSFM을 사용한 세포 내 분해능으로 3D 뇌 재구성을 위해 여러 인간 뇌 두께 절편의 신속한 동시 처리에 SHORT 조직 형질전환 방법을 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.

다른 접근 방식과 달리 SHORT 방법을 사용하?...

공개

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구에서 분석된 인간 뇌 표본을 제공해 주신 매사추세츠 종합 병원, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology의 Bruce Fischl에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 보조금 계약 번호 654148(Laserlab-Europe)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프레임워크 프로그램으로부터, 특정 보조금 계약 번호 785907(Human Brain Project SGA2) 및 No. 945539(Human Brain Project SGA3)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation으로부터 자금을 지원받았으며, 수상 번호 U01 MH117023에 따라 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 종합병원 법인 센터(General Hospital Corporation Center)로부터 보조금을 받았습니다. Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI 연구 인프라)의 틀에서 이탈리아 교육부에서. 마지막으로, 이 연구는 "Fondazione CR Firenze"의 기여로 수행되었습니다. 이 작업의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 국립보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2'-thiodiethanolMerck Life Science S.R.L.166782
Acetamide >= 99.0% (GC)Merck Life Science S.R.L.160
Agarose High EEOMerck Life Science S.R.L.A9793
Boric AcidMerck Life Science S.R.L.B7901
Compressome VF-900-0Z MicrotomePrecisionary/
CoverslipsLaserOptex/customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateMerck Life Science S.R.L.E5134
GlutaraldehydeMerck Life Science S.R.L.G7651
GlycineSanta Cruz BiotechnologySC_29096
Hydrogen Peroxide 30%Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075Lab companion /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)//custom-made
Loctite AttakHenkel Italia srl/
Microscope slidesLaborchimica/customized
Phospate buffer saline tabletMerck Life Science S.R.L.P4417
Picodent TwinsilPicodent13005002out of production
Potassium Hydrogen PhtalateMerck Life Science S.R.L.P1088
Sodium AzideMerck Life Science S.R.L.S2002
Sodium Dodecyl SulfateMerck Life Science S.R.L.L3771
Sodium SulfiteMerck Life Science S.R.L.S0505
SpacersMicrolaser srlcustomized
Sputum Containers (dishes with screw lids)Paul Boettger GmbH & Co. KG07.061.2000
Tris BasePanReac AppliChem (ITW reagents)A4577,0500
Triton X-100Merck Life Science S.R.L.T8787
TubesSarstedt62 547254
Tween 20Merck Life Science S.R.L.P9416
Vibratome VT1000SLeica Biosystem/
Water bath MemmertWNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-545-215Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch805-545-180Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Reasearch611-605-215Dilution used, 1:200
Anti-NeuN AntibodyMerck Life Science S.R.L.ABN91Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)Abcamab32895Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)Abcamab8069Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibodyProteinTech12278_1_APDilution used, 1:200
DAPIThermoFisherD3571Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175700Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150107Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175470Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbedAbcamab175475Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)Abcamab175711Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)Abcamab150171Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150077Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibodyAbcamab194324Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7Santa Cruz Biotechnologysc-47706Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)ProteinTech16233-1-APDilution used, 1:200

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