Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

요약

본 프로토콜은 (SWITCH - _{H 2}O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

초록

지난 10년 동안 등장한 수많은 클리어링 기술에도 불구하고 사후 인간 뇌를 처리하는 것은 크기와 복잡성으로 인해 마이크로미터 해상도의 이미징을 특히 어렵게 만드는 어려운 작업으로 남아 있습니다. 이 논문은 광시트 형광 현미경(LSFM)으로 샘플의 투명화, 라벨링 및 순차 이미징을 가능하게 하는 SHORT(SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) 조직 형질 전환 프로토콜로 수십 개의 섹션을 동시에 처리하여 인간 뇌의 체적 부분을 재구성하는 프로토콜을 제시합니다. SHORT는 여러 신경 세포 마커가 있는 두꺼운 절편의 신속한 조직 투명화 및 균질한 다중 표지를 제공하여 백질 및 회백질 모두에서 다양한 신경 하위 집단을 식별할 수 있습니다. 클리어링 후 슬라이스는 LSFM을 통해 마이크로미터 해상도로 여러 채널에서 동시에 이미징되어 신속한 3D 재구성이 가능합니다. 일상적으로 높은 처리량의 프로토콜 내에서 SHORT와 LSFM 분석을 결합함으로써 짧은 시간에 고해상도로 큰 부피 영역의 3D 세포 구조 재구성을 얻을 수 있으므로 인간 뇌의 포괄적인 구조적 특성 분석이 가능합니다.

서문

대량의 인간 뇌의 3D 분자 조직과 세포 구조를 분석하려면 광범위한 처리 시간이 소요되는 프로토콜을 통해 표본의 광학적 투명성이 필요합니다. 광학 투명화 기술은 조직 내 굴절률(RI)의 이질성을 최소화하여 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 위한 광 투과 깊이를 증가시키기 위해 개발되었습니다 1,2,3,4,5. 투명화 및 심층 조직 표지 방법의 현재 발전은 최첨단 현미경 기술 6,7,8,9,10,11,12 을 활용하여 온전한 설치류 장기 및 배아의 체적 이미징을 가능하게 합니다.

프로토콜

포르말린 고정 인체 조직 샘플은 매사추세츠 종합병원(MGH) 부검 서비스(미국 보스턴)의 신경병리학과에서 제공하였다. 서면 동의는 Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC, 프로토콜 2003P001937)의 IRB 승인 조직 수집 프로토콜에 따라 사망 전에 건강한 참가자로부터 얻었습니다. 승인 문서는 미국 매사추세츠주 보스턴에 있는 MGH 부검 서비스에 보관되며 요청 시 제공됩니다.

1. 아가로스 임베딩 및 시료 절단

1. 비커에 4x 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)에 1% w/v 아가로스 용액을 준비하고 내부에 조직 블록을 삽입합니다. 실온(RT)에 도달할 때까지 기다렸다가 4°C에서 24시간 동안 보관합니다.
2. 고정밀 절편을 얻으려면 샘플을 비브라톰의 시편 디스크에 붙이고 트레이를 차가운 1x PBS(pH 7.4)로 채웁니다. 슬라이스할 조직의 유형에 따라 주파수, 진폭 및 속도와 같은 진동 매개변수를 조정합니다(사용된 값: 주파수 = 5(50Hz), 진폭 = 0.4, 속도 = 3(0.15mm/s).
   알림: 샘플 볼륨에 따라 다른 진동을 사용해야 합니다. 최대 부피가 70 x 40 x 15 mm인 샘플의 경우 진동체(예:....

토론

인간의 큰 뇌 부위를 고분해능 이미징 및 3D로 재구성하려면 기계적 조직 절편에 이어 광학 투명화 및 단일 절편의 면역 표지가 필요합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 LSFM을 사용한 세포 내 분해능으로 3D 뇌 재구성을 위해 여러 인간 뇌 두께 절편의 신속한 동시 처리에 SHORT 조직 형질전환 방법을 사용할 수 있는 방법을 설명합니다.

다른 접근 방식과 달리 SHORT 방법을 사용하?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200