Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme

Özet

Mevcut protokol, (SWITCH - _H2O2 - Antijen Reterival - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) KISA doku transformasyon tekniğini rutin olarak yüksek verimli bir protokolde ışık tabakası floresan mikroskobu görüntüleme ile birleştirerek onlarca postmortem insan beyni kesitinin hızlı ve eşzamanlı optik temizleme, çok yönlü etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için adım adım bir prosedür sağlar.

Özet

Son on yılda ortaya çıkan çok sayıda temizleme tekniğine rağmen, ölüm sonrası insan beyinlerinin işlenmesi, mikrometre çözünürlüğünde görüntülemeyi özellikle zorlaştıran boyutları ve karmaşıklığı nedeniyle zorlu bir görev olmaya devam ediyor. Bu makale, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) ile numunelerin temizlenmesini, etiketlenmesini ve sıralı görüntülenmesini sağlayan SHORT (S WITCH - H₂O₂ - Antijen Retrivansı - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) doku transformasyon protokolü ile onlarca kesiti aynı anda işleyerek insan beyninin hacimsel bölümlerinin rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktadır. SHORT, hem beyaz hem de gri maddede farklı nöronal alt popülasyonların tanımlanmasını sağlayarak, çeşitli nöronal belirteçlerle hızlı doku temizliği ve kalın dilimlerin homojen çoklu etiketlenmesini sağlar. Temizlendikten sonra, dilimler hızlı bir 3D rekonstrüksiyon için LSFM aracılığıyla mikrometre çözünürlüğünde ve aynı anda birden fazla kanalda görüntülenir. SHORT'u rutin olarak yüksek verimli bir protokol içinde LSFM analizi ile birleştirerek, kısa sürede yüksek çözünürlükte büyük hacimsel alanların 3D sitomimari rekonstrüksiyonunu elde etmek ve böylece insan beyninin kapsamlı yapısal karakterizasyonunu sağlamak mümkündür.

Giriş

İnsan beyninin büyük hacimlerinin 3D moleküler organizasyonunu ve sitomimarisini analiz etmek, kapsamlı işlem süresine sahip protokoller aracılığıyla elde edilen örneklerin optik şeffaflığını gerektirir. Dokulardaki kırılma indisindeki (RI) heterojenliği en aza indirmek, böylece ışık saçılımını azaltmak ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyon derinliğini artırmak için optik temizleme teknikleri geliştirilmiştir 1,2,3,4,5. Temizleme ve derin doku etiketleme yöntemlerindeki mevcut gelişmeler, en son mikroskopi tekniklerinden yararlanarak bozulmamış kemirgen organlarının ve embriyoların hacimsel olarak görüntülenmesine izin verir^{6,7,8,9,10,11,12}.

Bununla birlikte, ölüm sonrası insan beyninin geniş alanlarının hacimsel 3D rekonstrüksiyonu, model organizmalarla karşılaştırıldığında hala zorlu bir görevi temsil ediyor. Karmaşık biyolojik bileşim ve değişken postmortem fiksasyon ve saklama koşulları, doku temizleme etkinliğini, antikor penetrasyon derinliğini ve epitop tanıma 13,14,15,16,17,18,19'u tehlikeye atabilir. Ayrıca, büyük insan beyni alanlarının verimli bir şekilde temizlenmesi ve tek tip etiketlenmesi elde etmek için mekanik doku kesitleri ve ardından her dilimin temizlenmesi ve etiketlenmesi hala gereklidir, bu da model organizmalara kıyasla uzun işlem sürelerine ve sofistike özel ekipman ihtiyacına neden olur 15,20,21,22.

SWITCH - H₂O₂ - antijen Retrieval -TDE (KISA) doku dönüşüm tekniği, insan beyninin büyük hacimlerini analiz etmek için özel olarak geliştirilmiştir^18,23. Bu yöntem, epitop restorasyonu ile birlikte doku otofloresansını azaltmak için SWITCH protokolü^11'in doku yapısal korumasını ve yüksek konsantrasyonlarda peroksit hidrojeni kullanır. SHORT, farklı nöronal alt tipler, glial hücreler, damar sistemi ve miyelinli lifler için belirteçlerle insan beyni dilimlerinin düzgün boyanmasına izin verir^18,24. Sonuçları hem düşük hem de yüksek yoğunluklu proteinlerin analizi ile uyumludur. Ortaya çıkan yüksek şeffaflık seviyeleri ve tek tip etiketleme, floresan mikroskobu ile kalın dilimlerin hacimsel olarak yeniden yapılandırılmasını sağlar, özellikle hızlı elde etme için ışık tabakası aparatı kullanılabilir 18,24,25,26,27.

Bu çalışmada, KISA doku dönüşüm tekniğinin, formalinle sabitlenmiş onlarca insan beyni bölümünün aynı anda temizlenmesi ve çok yönlü etiketlenmesi için nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz. Dört farklı floresan işaretleyici birlikte kullanılabilir ve bu da farklı hücresel alt popülasyonların tanımlanmasına yol açar. Temizledikten sonra, floresan mikroskobu ile yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme yapılabilir. Burada, numunenin hızlı optik kesitini ve paralel olarak birden fazla kanalın hızlı bir şekilde alınmasını sağlayan özel yapım ters çevrilmiş bir LSFM 18,24,25,26,27 kullandık. Bu rutin olarak yüksek verimli protokolle, tüm Broca alanının haritalanmasında gösterildiği gibi, insan beyninin geniş alanlarının hücre altı çözünürlüğü ile kapsamlı bir hücresel ve yapısal karakterizasyon elde etmek mümkündür²³.

Protokol

Formalinle sabitlenmiş insan doku örnekleri, Massachusetts General Hospital (MGH) Otopsi Servisi (Boston, ABD) Nöropatoloji Bölümü tarafından sağlandı. Ortaklar Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nden IRB onaylı doku toplama protokollerini takiben ölümden önce sağlıklı katılımcılardan yazılı onay alındı (PIBC, protokol 2003P001937). Yetki belgeleri, Boston, MA, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki MGH Otopsi Hizmetlerinde saklanır ve talep üzerine temin edilebilir.

1. Agaroz gömme ve numune kesme

1. Bir beherde 1x fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) içinde% 4 w / v agaroz çözeltisi hazırlayın ve doku bloğunu içine gömün. Oda sıcaklığına (RT) ulaşana kadar bekleyin ve ardından 4 °C'de 24 saat saklayın.
2. Yüksek hassasiyetli kesitler elde etmek için numuneyi vibratomun numune diskine yapıştırın ve tepsiyi soğuk 1x PBS (pH 7.4) ile doldurun. Dilimlenecek doku tipine göre frekans, genlik ve hız gibi vibratom parametrelerini ayarlayın (kullanılan değerler: frekans = 5 (50 Hz); genlik = 0.4; hız = 3 (0.15 mm/s).
   NOT: Numune hacmine bağlı olarak farklı vibratomlar kullanılmalıdır. Maksimum hacmi 70 x 40 x 15 mm olan numuneler için bir vibratom (örneğin, Leica VT1000 S) kullanılabilir; daha büyük numuneler için bir sıkıştırma (örneğin, VF-900-0Z Mikrotom¹⁸) veya özel yapım bir aparat²¹ kullanmak mümkündür. Burada 400 μm veya 500 μm kalınlığında kesilmiş dilimler sunuyoruz.
3. Kestikten sonra, tüm dilimleri %0,01 w/v Sodyum Azid (_NaN3) ile 1x PBS (pH 7.4) içeren bir koruyucu solüsyona koyun ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Gömmeden önce, agaroz çözeltisi 37 °C'ye ulaşana kadar bekleyin. Daha yüksek bir sıcaklık numuneye zarar verebilir. Uzun süreli fiksasyon, antijenlere zarar vererek ve doku otofloresansını artırarak etiketleme prosedürüne müdahale edebileceğinden, numunelerin PFA'da 48 saatten fazla bırakılmaması önerilir. İnsan dokularının uzun süreli depolanması için, mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için NaN_3'lü PBS kullanılır. _NaN3'ün toksisitesi nedeniyle, koruyucu çözeltiyi kimyasal bir başlık altında hazırlayın.

2. Doku fiksasyonu

NOT: Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm solüsyonlar, aynı doku bloğunun tüm dilimlerini işlemek ve teknik değişkenliği en aza indirmek ve bireysel adımlar için süreyi azaltmak için yeterli olan büyük hacimlerde hazırlanmıştır.

1. %50 v/v 1x PBS pH 3, %25 v/v 0,1 M hidroklorik asit (HCl), %25 v/v 0,1 M potasyum hidrojen ftalat (KHP) ve taze %4 v/v glutaraldehit içeren kapatma solüsyonunu hazırlayın. Tüm numuneleri vidalı kapaklı (70 x 23 mm) tabaklara yerleştirin ve alüminyum folyo ile ışıktan koruyarak 1 gün boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak Kapatma solüsyonu ile inkübe edin.
2. Açma solüsyonunu 1x PBS (pH 7.4) ve taze %1 v/v glutaraldehit ile hazırlayın. Tüm numuneleri yeni kaplara yerleştirin ve 1 gün boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak Switch-on solüsyonu ile inkübe edin ve alüminyum folyo ile ışıktan koruyun.
   NOT: Gluteraldehitin yüksek toksisitesi ve ışık hassasiyeti nedeniyle, hem Kapatma hem de Açma çözeltileri her zaman taze olarak hazırlanmalı ve kimyasal kaputun altında buz üzerinde tutulmalıdır. Çanağı her zaman her çözeltiden 20 mL ile doldurun ve parafilm ile kapatın.

3. Devre dışı bırakma ve temizleme

NOT: Numunelerdeki reaktif glutaraldehit, 1x PBS pH 7.4, %4 w/v asetamid, %4 w/v glisin, pH 9.0'dan oluşan bir inaktivasyon solüsyonu ile inkübe edilerek inaktive edilmelidir. Çözelti 4 °C'de 3 aya kadar saklanabilir. Lipitleri uzaklaştırmak ve dokuyu şeffaf hale getirmek için 200 mM sodyum dodesil sülfat (SDS), 20 mM sodyum sülfit (_Na2S3) ve 20 mM borik asit (_H3BO3), pH 9.0'dan oluşan temizleme solüsyonunu kullanıyoruz. SDS 4 °C'de çökeldiği için çözelti RT'de saklanmalıdır. Aşağıdaki tüm adımlar çözelti ile doldurulmuş tüplerde yapılacaktır.

1. Numuneleri bulaşıklardan tüplere taşıyın ve RT'de 1x PBS pH 7.4 ile 3 x 2 saat boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
   NOT: Adım 3.1 için, glutaraldehit toksisitesi nedeniyle kimyasal başlık altında çalışmak gerekir. Asetamid ve borik asit de toksik reaktiflerdir ve kimyasal bir başlık altında ele alınmaları gerekir. Tüpü her zaman her çözeltiden 50 mL ile doldurun.
2. Numuneleri inaktivasyon solüsyonu içinde 37 °C'de bir su banyosunda gece boyunca inkübe edin (o/n).
3. RT'de 1x PBS pH 7.4'te 3 x 2 saat boyunca hafifçe çalkalayarak yıkayın.
4. Numuneleri temizleme solüsyonunda 55 °C'de bir su banyosunda 3-7 gün inkübe edin. Çözeltiyi her 2 günde bir değiştirin (Tablo 1).

4. İmmün etiketleme

NOT: Etiketleme adımından önce, 10 mM Tris bazı, 1 mM EDTA ve %0.05 v/v Tween 20, pH 9'dan oluşan bir antijen alma solüsyonu ile artık SDS'nin çıkarılması, otofloresansı azaltmak ve epitopların maskesini kaldırmak gerekir. Çözeltinin pH'ı 9, verimli bir geri alma işlemi için optimize edilmiştir; Tris bazı, stabil bir pH ortamını korumak için bir tamponlama maddesi görevi görür; Bir kenetleme ajanı olan EDTA, antijenin erişilebilirliğini arttırır. Noniyonik deterjan Tween 20, dokunun geçirgenliğini artırmaya yardımcı olur. Bu çözelti 4 °C'de saklanabilir. Antijen alma aşaması ile birleştirilen hidrojen peroksitin, spesifik olmayan arka plan sinyalinden (lipofuscin gibi) sorumlu endojen floroforları parçalayarak ve/veya modifiye ederek otofloresan sinyalini azaltmada sinerjik bir etkiye sahip olduğuna dikkat etmek önemlidir.

1. %0,1 v/v Triton X-100 (PBST) ile 1x PBS hazırlayın, önceden 37 °C'ye ısıtın ve numuneleri inkübatörde 37 °C'de hafifçe çalkalayarak gün boyunca 3 x 3 saat yıkayın. Son yıkamayı o / n'ye bırakın.
   NOT: PBST stok çözeltisini 4 °C'de saklayın. SDS'nin dokudan uzaklaştırılması çok önemlidir, çünkü düşük sıcaklıklarda sonraki edinim süreçlerine müdahale edebilecek çözünmez çökeltiler oluşturabilir.
2. Ertesi gün, her numuneye 10 mL %30 v/v hidrojen peroksit (_H2O2) ekleyin ve RT'de 45 dakika hafifçe çalkalayarak bırakın.
3. RT'de hafifçe çalkalayarak 1x PBS (pH 7.4) ile 3 x 10 dakika yıkayın.
4. Antijen alma solüsyonunu bir su banyosunda 95 °C'de önceden ısıtın; numuneleri ısıtılmış çözeltiye aktarın ve 95 °C'de 10 dakika bekletin.
5. Numunelerin hafifçe çalkalayarak 40 dakika RT'ye soğumasını bekleyin.
6. 3 x 5 dakika deiyonize su ile hafifçe çalkalayarak yıkayın.
7. Numuneleri PBS'de 4 °C'de 15 dakika dengeleyin.
8. % 0.01 w / v NaN₃ içeren PBST'den yapılmış taze antikor çözeltisi hazırlayın (adım 1.3 için NOT'a bakın) ve birincil antikorları ekleyin. Numuneleri, vidalı kapaklı kaplarda çözelti ile 37 ° C'de n gün (1-7) boyunca bir inkübatörde hafifçe çalkalayarak ve ışıktan koruyarak inkübe edin (Tablo 2).
   NOT: Kuluçka süresi boyuta ve kalınlığa bağlıdır (Tablo 1 ve Tablo 2).
9. N gün sonra, numuneleri tüplere taşıyın ve inkübatörde hafifçe çalkalayarak 37 ° C'de önceden ısıtılmış PBST ile 3 x 2 saat yıkayın.
10. PBST'ye %0.01 w/v_NaN3 ile ikincil antikorlar ekleyin ve numuneleri vidalı kapaklı yeni kaplarda 37 °C'de n gün (1-6) boyunca bir inkübatörde hafifçe çalkalayarak ve ışıktan koruyarak inkübe edin (Tablo 1 ve Tablo 2).
11. N gün sonra, numuneleri tüplere aktarın ve gün boyunca 3 x 3 saat önceden ısıtılmış PBST ile 37 °C'de hafifçe çalkalanan bir inkübatörde yıkayın. Son yıkamayı o / n'ye bırakın.
    NOT: Triton X-100 ve Tween 20 viskoz olduğundan, ucun dolması için yavaşça pipetleyin. Tüpü her zaman her çözeltiden 50 mL ile doldurun. Her numune için 10 mL antikor solüsyonu kullanın ve solüsyonun buharlaşmasını önlemek için kabı parafilm ile kapatın. Antikor çözeltileri NaN 3 içerdiğinden_, 4 ° C'de saklanabilir ve 2 hafta içinde yeni örnekleri etiketlemek için yeniden kullanılabilir.

5. Kırılma indisi eşleştirme

NOT: Yüksek düzeyde şeffaflık elde etmek için, doku kırılma indisini homojenize etmek gerekir. Burada 1x PBS'de seyreltilmiş 2,2'-tiyodietanol (TDE) kullanıyoruz. TDE çözümleri RT'de depolanmalıdır.

1. Numuneleri yeni tabaklara aktarın, %30 v/v TDE ekleyin ve RT'de hafifçe çalkalayarak 4 saat bekletin.
2. %30 v/v TDE çözeltisini çıkarın, numunelere %68 v/v TDE ekleyin ve RT'de hafifçe çalkalayın.
   NOT: TDE viskoz olduğundan, ucun dolmasını sağlamak için yavaşça pipetleyin. TDE buharının veya sisinin solunması solunum sistemini tahriş edebilir. Bu nedenle, maruziyeti en aza indirmek için iyi havalandırılan bir alanda çalışmanız veya çeker ocak kullanmanız önerilir. Her numune için 10 mL TDE solüsyonu kullanın.

6. Örnek montaj

NOT: Numune montajını ve LSFM görüntü alımını kolaylaştırmak için, üç parçadan oluşan ısmarlama, sızdırmaz bir numune tutucu ("sandviç" olarak adlandırılır) kullanıyoruz: bir mikroskop lam, bir ara parça ve bir lamel .

1. Çelik ara parçayı (56 x 56 x 0.5 mm³) mikroskop lamının (60 x 60 x 1 mm³) üzerine yerleştirin ve numuneyi mikroskopi lamına yerleştirin.
2. Kuvars lamel (60 x 60 x 0,5 mm³) dikkatlice yerleştirin, her şeyi bir araya getirin ve 1:1 oranında iki bileşenli bir silikon yapıştırıcı hazırlayın. Kırılma indisini eşleştirmek ve edinme işlemi sırasında optik sapmayı azaltmak için bir kuvars lamel kullanın.
3. 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, ara parça ile lamel arasındaki boşluğu iki bileşenli bir silikon yapıştırıcı ile doldurun ve 10 dakika kurumasını bekleyin.
4. Klipsleri çıkarın ve tüm sandviçi %68 v/v TDE ile yavaşça doldurmak için küçük bir iğne kullanın.
5. Taze tutkal yapın ve sandviçi kapatın.
   NOT: TDE yanlışlıkla adım 6.1'de ara parçaya ulaşırsa, yapıştırıcı sertleşmez. Adım 6.2'de hava kabarcığı oluşmadığından emin olun.

7. Sıyırma

NOT: SHORT'un yapısal koruması ve gelişmiş epitop erişilebilirliği, antikorları çıkararak ve numuneleri diğer belirteçlerle yeniden boyayarak dilimlerin çok yönlü etiketlenmesine izin verir.

1. Sandviçi bir bıçakla açın, numuneleri %30 v/v TDE ile doldurulmuş vidalı kapaklı yeni kaplara koyun ve 3 saat bekletin.
2. Numuneleri tüplere aktarın, RT'de 1x PBS'de (pH 7.4) 3 x 2 saat hafifçe çalkalayarak yıkayın ve son yıkamayı o / n bırakın.
3. Numuneleri 4 saat boyunca 80 ° C'de bir su banyosunda temizleme çözeltisine yerleştirin.
4. 1x PBST'de (pH 7.4) 37 °C'de 3 x 2 saat hafifçe çalkalayarak yıkayın ve son yıkamayı o/n bırakın. Artık numune, 4.8 adımından başlayarak tekrar etiketlenmeye hazırdır.
   NOT: Tüpü her zaman her çözeltiden 50 mL ile doldurun. Her numune için 10 mL TDE çözeltisi kullanın.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol, SHORT yöntemi kullanılarak kalınlıkları 100 μm ila 500 μm arasında değişen birden fazla dilimin aynı anda işlenmesini sağlar. Bu yaklaşım, tüm prosedür için genel işlem süresini önemli ölçüde azaltır. Bu çalışmada, birden fazla ölüm sonrası insan beyni kalın kesitini aynı anda işlemek için tüm boru hattının kapsamlı bir tanımını (Şekil 1) sunuyoruz ve protokolü aynı anda 24 dilim üzerinde gösteriyoruz (

Tartışmalar

Büyük insan beyni alanlarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyonu, mekanik doku kesiti ve ardından tek dilimlerin optik olarak temizlenmesi ve immüno-etiketlenmesini gerektirir. Burada sunulan protokol, KISA doku transformasyon yönteminin, LSFM ile hücre altı çözünürlüğe sahip 3D beyin rekonstrüksiyonu için çoklu insan beyninin kalın kesitlerinin hızlı ve eşzamanlı işlenmesi için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.

Diğer yakla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200