Büyük Ölçekli İnsan Beyni Görüntülemede Işık Tabakası Floresan Mikroskobu için Optik Temizleme ve Etiketleme

Özet

Mevcut protokol, (SWITCH - _H2O2 - Antijen Reterival - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) KISA doku transformasyon tekniğini rutin olarak yüksek verimli bir protokolde ışık tabakası floresan mikroskobu görüntüleme ile birleştirerek onlarca postmortem insan beyni kesitinin hızlı ve eşzamanlı optik temizleme, çok yönlü etiketleme ve 3D hacimsel rekonstrüksiyonu için adım adım bir prosedür sağlar.

Özet

Son on yılda ortaya çıkan çok sayıda temizleme tekniğine rağmen, ölüm sonrası insan beyinlerinin işlenmesi, mikrometre çözünürlüğünde görüntülemeyi özellikle zorlaştıran boyutları ve karmaşıklığı nedeniyle zorlu bir görev olmaya devam ediyor. Bu makale, ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) ile numunelerin temizlenmesini, etiketlenmesini ve sıralı görüntülenmesini sağlayan SHORT (S WITCH - H₂O₂ - Antijen Retrivansı - 2,2'-tiyodietanol [TDE]) doku transformasyon protokolü ile onlarca kesiti aynı anda işleyerek insan beyninin hacimsel bölümlerinin rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktadır. SHORT, hem beyaz hem de gri maddede farklı nöronal alt popülasyonların tanımlanmasını sağlayarak, çeşitli nöronal belirteçlerle hızlı doku temizliği ve kalın dilimlerin homojen çoklu etiketlenmesini sağlar. Temizlendikten sonra, dilimler hızlı bir 3D rekonstrüksiyon için LSFM aracılığıyla mikrometre çözünürlüğünde ve aynı anda birden fazla kanalda görüntülenir. SHORT'u rutin olarak yüksek verimli bir protokol içinde LSFM analizi ile birleştirerek, kısa sürede yüksek çözünürlükte büyük hacimsel alanların 3D sitomimari rekonstrüksiyonunu elde etmek ve böylece insan beyninin kapsamlı yapısal karakterizasyonunu sağlamak mümkündür.

Giriş

İnsan beyninin büyük hacimlerinin 3D moleküler organizasyonunu ve sitomimarisini analiz etmek, kapsamlı işlem süresine sahip protokoller aracılığıyla elde edilen örneklerin optik şeffaflığını gerektirir. Dokulardaki kırılma indisindeki (RI) heterojenliği en aza indirmek, böylece ışık saçılımını azaltmak ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ışık penetrasyon derinliğini artırmak için optik temizleme teknikleri geliştirilmiştir 1,2,3,4,5. Temizleme ve derin doku etiketleme yöntemlerindeki mevcut gelişmeler,....

Protokol

Formalinle sabitlenmiş insan doku örnekleri, Massachusetts General Hospital (MGH) Otopsi Servisi (Boston, ABD) Nöropatoloji Bölümü tarafından sağlandı. Ortaklar Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nden IRB onaylı doku toplama protokollerini takiben ölümden önce sağlıklı katılımcılardan yazılı onay alındı (PIBC, protokol 2003P001937). Yetki belgeleri, Boston, MA, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki MGH Otopsi Hizmetlerinde saklanır ve talep üzerine temin edilebilir.

1. Agaroz gömme ve numune kesme

1. Bir beherde 1x fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) içinde% 4 w / v agaroz çözeltisi hazırlayın ve doku bloğunu içine gömün. Od....

Tartışmalar

Büyük insan beyni alanlarının yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyonu, mekanik doku kesiti ve ardından tek dilimlerin optik olarak temizlenmesi ve immüno-etiketlenmesini gerektirir. Burada sunulan protokol, KISA doku transformasyon yönteminin, LSFM ile hücre altı çözünürlüğe sahip 3D beyin rekonstrüksiyonu için çoklu insan beyninin kalın kesitlerinin hızlı ve eşzamanlı işlenmesi için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.

Diğer yakla.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200