طريقة فعالة وسريعة لوضع العلامات وتحليل كبيبات الماوس

Summary

تقدم هذه الدراسة مجموعة سهلة الاستخدام وكاملة وبسيطة من الطرق لتسمية وتحليل الكبيبات من كليتي الفئران التي تم تطهيرها من CUBIC. يمكن الحصول على بيانات مثل رقم الكبيبة وحجمها بسهولة وموثوقية باستخدام إيزوثيوسيانات الفلوريسئين (FITC) -Dextran ، أو الفحص المجهري الفلوري للصفائح الضوئية (LSFM) ، أو الفحص المجهري البؤري المشترك والبرامج مثل Imaris.

Abstract

الكبيبات هي وحدات أساسية في الكلى. ومن ثم ، فإن دراسة الكبيبات أمر محوري لفهم وظائف الكلى وعلم الأمراض. يوفر التصوير البيولوجي معلومات بديهية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان تسمية الكبيبات ومراقبتها. ومع ذلك ، فإن طرق مراقبة الكبيبات المستخدمة حاليا تتطلب عمليات معقدة ، وقد تفقد النتائج تفاصيل التسمية أو المعلومات ثلاثية الأبعاد (3D). تم استخدام كوكتيلات تصوير الدماغ الواضحة والخالية من العوائق وتقنية مسح الأنسجة بالتحليل الحسابي (CUBIC) على نطاق واسع في أبحاث الكلى ، مما يسمح باكتشاف أكثر دقة وعمق اكتشاف أعمق. وجدنا أنه يمكن تمييز كبيبات الفئران بسرعة وفعالية عن طريق حقن الوريد الذيل للوزن الجزيئي المتوسط FITC-Dextran متبوعا بطريقة المقاصة المكعبة. يمكن مسح كلية الفأر التي تم تطهيرها بواسطة مجهر ضوئي (أو مجهر متحد البؤر عند تقطيعها) للحصول على أكوام صور ثلاثية الأبعاد لجميع الكبيبات في الكلية بأكملها. يمكن بسهولة رقمنة إشارات الكبيبات وتحليلها لقياس عدد الكبيبات وحجمها وتواترها.

Introduction

عدد وحجم الكبيبات مهمة جدا لتشخيص وعلاج أمراض الكلى المختلفة^{1،2،3،4،5}. المعيار الذهبي لتقدير عدد الكبيبات هو تركيبة التشريح المادي / المجزأ. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة كواشف ومعدات خاصة ، مما يجعلها بطيئة ومكلفة^6،7،8،9. توفر الخزعة ثروة من المعلومات ، ولكن من الواضح أن هذه الطريقة مناسبة فقط للتقديرات التقريبية^10,11. كما ....

Protocol

تم استخدام الفئران البالغة C57BL / 6 (6 أسابيع من العمر ، 25-30 جم) في هذه الدراسة. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للوائح المحلية لرعاية وأخلاقيات التجارب. تمت الموافقة على الدراسة من قبل مستشفى غرب الصين التابع للجنة أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية بجامعة سيتشوان.

1. وضع العلامات الكبيبات وإعداد الأنسجة

1. وضع العلامات الكبيبات
   1. قم بإذابة FITC-dextran (10 مجم) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بنسبة 1: 1 (1 مجم: 1 مل) لتحضير محلول مسبار العمل.
      ملاحظة: يمكن تخزين حل العمل في 4 °C لمدة 1 شهر.
   2. ضع الماوس C57 في مثبت وريد ذيل الماوس. بلل الشاش بالماء الساخن ، لف الشاش حول الجزء الأوسط من ذيل الماوس ، وق....

النتائج

توفر هذه الدراسة طريقة بسيطة وفعالة لوضع العلامات وتحليل الكبيبات في كلى الفئران.

يمكن تمييز الكبيبات (الأوعية الدموية) بشكل جيد عن طريق حقن FITC-Dextran داخل الأوعية الدموية. بعد عملية المقاصة ، أصبحت الكلية شفافة (الشكل 1 أ) ، ويمكن ملاحظة الكبيبات بوضوح باستخدا?.......

Discussion

يمكن تصنيف تقنيات إزالة الأنسجة إلى 3 أو 4 مجموعات^29،30،31. تم تطبيق إزالة الأنسجة القائمة على المذيبات العضوية (على سبيل المثال ، DISCO و PEGASOS) ، وتنظيف الأنسجة المائية (على سبيل المثال ، CUBIC) ، وتطهير الأنسجة بتضمين الهيدروجيل (على سبيل المثال ، .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent