Un metodo efficiente e veloce per l'etichettatura e l'analisi dei glomeruli di topo

Riepilogo

Questo studio presenta una serie di metodi facili da usare, completi e semplici per etichettare e analizzare i glomeruli da reni di topo eliminati da CUBIC. Dati come il numero e il volume del glomerulo possono essere ottenuti in modo semplice e affidabile utilizzando l'isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano, la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM) o la comune microscopia confocale e software come Imaris.

Abstract

I glomeruli sono unità fondamentali del rene; Pertanto, lo studio dei glomeruli è fondamentale per comprendere la funzione e la patologia renale. L'imaging biologico fornisce informazioni intuitive; Pertanto, è di grande importanza etichettare e osservare i glomeruli. Tuttavia, i metodi di osservazione dei glomeruli attualmente in uso richiedono operazioni complicate e i risultati possono perdere i dettagli dell'etichetta o le informazioni tridimensionali (3D). La tecnologia di eliminazione dei tessuti CUBIC (Brainmental Imaging Cocktails and Computational Analysis) chiara e senza ostacoli è stata ampiamente utilizzata nella ricerca renale, consentendo un rilevamento più accurato e una profondità di rilevamento più profonda. Abbiamo scoperto che i glomeruli di topo possono essere marcati in modo rapido ed efficace mediante iniezione di vena caudale di destrano FITC-destrano a medio peso molecolare seguita dal metodo di compensazione CUBIC. Il rene di topo ripulito potrebbe essere scansionato con un microscopio a foglio luminoso (o un microscopio confocale una volta tagliato) per ottenere pile di immagini tridimensionali di tutti i glomeruli nell'intero rene. Elaborati con un software appropriato, i segnali dei glomeruli potrebbero essere facilmente digitalizzati e ulteriormente analizzati per misurare il numero, il volume e la frequenza dei glomeruli.

Introduzione

Il numero e il volume dei glomeruli sono molto importanti per la diagnosi e il trattamento di varie malattie renali 1,2,3,4,5. Il golden standard della stima del numero di glomeruli è la combinazione dissettore fisico/frazionatore. Tuttavia, questo metodo richiede reagenti e attrezzature speciali, il che lo rende lento e costoso 6,7,8,9. La biopsia fornisce una grande quantità di informazioni, ma ovviamente questo metodo è adatto solo per stime approssimative^10,11. Le tecnologie di imaging medico, tra cui la risonanza magnetica (MRI), la tomografia computerizzata (TC) e i raggi X, sono anche ampiamente utilizzate nella rilevazione glomerulare 12,13,14,15, ma tali tecnologie richiedono strumenti ingombranti. Nuovi metodi, come lo spettrometro di massa per imaging a desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI)¹⁶ o il metodo della sezione spessa e sottile¹⁷, sono stati utilizzati anche nella rilevazione glomerulare, sebbene rimangano noiosi e laboriosi.

Con l'aiuto delle tecnologie di trasparenza, è possibile osservare profondità più profonde e ottenere informazioni più ricche e complete da tessuti spessi o addirittura da interi organi 18,19,20,21,22,23. Pertanto, le tecnologie di trasparenza sono state ampiamente utilizzate nella ricerca sui reni²⁴. Sono coinvolti anche l'osservazione e il rilevamento dei glomeruli nei reni puliti. Tuttavia, questi articoli pubblicati si riferivano solo brevemente alla rilevazione glomerulare²⁵ o utilizzavano metodi di marcatura difficili da raggiungere come gli animali transgenici²⁶, i coloranti autoprodotti¹³ o l'incubazione di anticorpi ad alta concentrazione²⁷ per etichettare i glomeruli. Inoltre, sebbene gli studi avessero analizzato i glomeruli nei reni chiariti, le analisi erano sempre limitate¹³ o si basavano su algoritmi di analisi stabiliti dagli autori stessi²⁶.

In precedenza abbiamo dimostrato un modo più conveniente per etichettare i glomeruli nei reni dei topi²⁸. Utilizzando Imaris, abbiamo scoperto che il numero, la frequenza e il volume dei glomeruli potevano essere ottenuti rapidamente. Pertanto, qui presentiamo un insieme più accessibile, completo e semplificato di metodi per etichettare e analizzare i glomeruli dei reni dei topi.

Protocollo

In questo studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 (6 settimane di età, 25-30 g). Tutte le procedure sono state eseguite nel rispetto delle normative locali in materia di benessere animale e di etica sperimentale. Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Biomedica dell'Ospedale della Cina Occidentale dell'Università del Sichuan.

1. Etichettatura dei glomeruli e preparazione dei tessuti

1. Etichettatura dei glomeruli
   1. Sciogliere il destrano FITC (10 mg) in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in un rapporto di 1:1 (1 mg: 1 mL) per preparare la soluzione della sonda di lavoro.
      NOTA: La soluzione di lavoro può essere conservata a 4 °C per 1 mese.
   2. Posiziona il mouse C57 in un fissatore per vene della coda di topo. Bagnare la garza con acqua calda, avvolgere la garza attorno alla parte centrale della coda del topo e scaldare la coda per 1 minuto.
   3. Pulisci la coda del topo con etanolo al 75% finché le vene della coda sinistra e destra non sono visibili.
   4. Prelevare 100 μL della soluzione della sonda di lavoro con una siringa da insulina da 1 mL e iniettare lentamente la soluzione nella vena caudale del topo.
   5. Dopo l'iniezione, lasciare circolare la soluzione della sonda per 30 minuti. Lascia che i topi si muovano liberamente nelle loro gabbie.
   6. Una volta raggiunta una circolazione sufficiente, anestetizzare in profondità i topi mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital di sodio (1%, 60-80 μg/kg).
2. Prelievo e fissazione del rene
   1. Fissare i topi anestetizzati alla placca anatomica in posizione supina. Fissa le zampe con del nastro adesivo.
   2. Dopo la preparazione della pelle, sopprimere i topi con una dose letale di pentobarbital di sodio (1%, 10 mg/kg).
   3. Praticare un'incisione addominale sulla linea mediana per esporre la cavità addominale.
   4. Rivelare i reni e rimuoverli con un bisturi e delle forbici nella cappa aspirante. Rimuovere delicatamente l'involucro renale.
   5. Prelevare i reni e fissarli in paraformaldeide (PFA) al 4% a 4 °C per una notte.
   6. Lavare i campioni con PBS tre volte 1 ora ciascuno con agitazione a temperatura ambiente (RT).
   7. Preparare il rene per la microscopia.
      1. Tagliare il rene per la microscopia confocale: tagliare il rene in fette spesse 1 mm utilizzando la matrice cerebrale (acciaio da 1 mm, 40-75 g) per standardizzare lo spessore della fetta. Trasferire le fette in PFA al 4% e continuare la fissazione a 4 °C per tutta la notte.
      2. Rene intero per microscopia a foglio ottico: fissare i reni in PFA al 4% a 4 °C per 48 ore.

2. Schiarimento

1. Preparazione dei reagenti
   1. Preparare il reagente CUBIC-L mescolando il 10% (wt/wt) di N-butildietanolammina, il 10% (wt/wt) di Triton X-100 e l'80% di ddH₂O.
   2. Preparare il reagente CUBIC-R mescolando il 45% (wt/wt) di antipirina, il 30% (wt/wt) di nicotinamide, lo 0,5% (vol/vol) di N-butildietanolammina e il 24,5% di ddH₂O. Assicurarsi che la soluzione abbia un pH di 9,6-9,8 e un indice di rifrazione (RI) di 1,522.
      NOTA: CUBIC-L viene utilizzato per la delipidazione e CUBIC-R viene utilizzato per la corrispondenza dell'indice di rifrazione.
2. Procedura di compensazione
   1. Raccogliere i campioni di rene in una provetta da centrifuga da 50 mL e poi pulirli in CUBIC-L con agitazione a 60 giri/min a 37 °C. Sostituire CUBIC-L ogni 4 ore (per le fette di rene) o ogni 24 ore (per un rene intero) fino ad ottenere una trasparenza ottica soddisfacente.
      NOTA: Questo processo richiede 1 giorno per le fette di rene e 5 giorni per un rene intero.
   2. Lavare i campioni tre volte in PBS agitando delicatamente a RT per 1 ora ciascuno.
   3. Applicare CUBIC-R sui campioni, agitando i campioni a 37 °C, 60 giri/min per 6 ore.
   4. Osservare direttamente i campioni eliminati o conservarli in provette nere riempite con CUBIC-R a RT per 1 settimana.

3. Acquisizione delle immagini

1. Imaging confocale
   NOTA: Acquisire un'immagine dei campioni di rene affettati con microscopia confocale (lenti: obiettivo Plan Apo λ 4×/0,2 N1 o obiettivo Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Acquisisci immagini di grandi dimensioni (ad esempio, 6052 μm x 6052 μm per la fetta di rene) con z-stack.
   1. Accendere il microscopio confocale nella seguente sequenza: alimentazione laser, interruttore di controllo confocale, computer, microscopio e hardware confocale. Dopo aver eseguito l'autotest, accendere il software confocale.
   2. Selezionare l'obiettivo appropriato. Rimuovere il campione dal reagente CUBIC-R, posizionarlo nella capsula confocale e coprirlo per evitare che il reagente CUBIC-R si secchi.
   3. Spostare il campione al centro del campo visivo e regolare il piano focale fino a quando non è a fuoco.
   4. Applicare la ricostruzione 3D (passaggio 3.1.4.1) e la ricostruzione di immagini di grandi dimensioni (passaggi 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. Ricostruzione 3D (confocale): Cambia il piano dello zoom in una direzione fino a quando non è visibile alcuna fluorescenza; Questa posizione è definita come la parte superiore. Quindi, spostare il piano dello zoom nella direzione opposta fino a quando non è visibile alcuna fluorescenza; Questa posizione è definita come il fondo. Fare clic sul pulsante Esegui nell'angolo in basso a destra della finestra di dialogo per avviare la scansione.
      2. Ricostruzione di immagini di grandi dimensioni (confocale): sposta il campo visivo al centro del campione e imposta la posizione corrente come centro. Selezionare un campo visivo 2 x 2.
      3. Nell'interfaccia multifunzione ND, selezionare la pila Z per ricostruire immagini di grandi dimensioni e impostare diverse opzioni nel pannello. Quindi premere il pulsante Esegui per avviare la scansione.
2. Imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso (LSFM)
   NOTA: Acquisire l'immagine dell'intero rene con un microscopio a fluorescenza a foglio luminoso (lente: EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (medio n = 1,529) obiettivo).
   1. Fissaggio del campione (LSFM):
      1. Incollare il rene trasparente all'adattatore di fissaggio del campione e attendere che il rene sia saldamente attaccato.
      2. Immergere il rene nel contenitore del campione e spingere il contenitore del campione nel sistema del microscopio. Chiudere il portello.
   2. Osservazione e scansione (LSFM):
      1. Nell'interfaccia Locate , spostare il campione in una posizione di osservazione adatta. Passare all'interfaccia di acquisizione , impostare il percorso ottico, selezionare laser a 488 nm, LBF 405/488/561/640, blocco filtro di divisione ottica SBS LP 490, selezionare Camera 2 e modificare lo pseudo-colore in verde.
      2. Immettere il valore Offset Z sinistro/destro registrato in precedenza nel sottomenu Canale . Selezionare lo zoom più piccolo (0,36) e regolarlo con precisione per ottenere la massima chiarezza.
   3. Trova il limite X\Y e l'intervallo Z dell'intero organo. Regolare l'intensità del laser e il tempo di esposizione (preferibilmente inferiore a 10 ms) e fare clic su Esegui per iniziare.
   4. Se il tessuto è troppo grande, unisci due o più immagini con l'unione delle immagini. Aprire il file acquisito utilizzando il software di microscopia (in questo caso, ZEISS ZEN 3.7). Selezionare Metodo di elaborazione > > Stitching > Parametro Metodo > Applica per completare l'unione dell'immagine.

4. Elaborazione e quantificazione dei dati

NOTA: Elaborare le pile di immagini con il software Imaris (analisi delle immagini), utilizzando la funzione Superficie per etichettare i glomeruli ed eseguire l'analisi.

1. Conte dei glomeruli
   1. Importazione di immagini di grandi dimensioni (microscopia confocale) o di immagini cucite (microscopia a foglio luminoso) nel software di analisi delle immagini.
   2. Aprire i file nel software di analisi delle immagini. Fare clic sul pulsante Superficie per creare una nuova superficie. Segui la guida nella parte in basso a sinistra dello schermo.
      1. Fare clic sul pulsante Avanti (pulsante freccia destra) senza spuntare nulla.
      2. Selezionare la casella prima dell'opzione Arrotonda e immettere un numero appropriato (ad esempio, 14,5) per controllare i dettagli della superficie. Selezionare Sottrazione sfondo in Thresholding e riempire la casella con il diametro medio approssimativo dei glomeruli. Fare clic sul pulsante Avanti .
      3. Regolare se necessario e fare clic sul pulsante Avanti . Selezionare l'intervallo corretto e fare clic sul pulsante Avanti per creare una superficie.
   3. Fare clic su Filtro, quindi sul pulsante Aggiungi per aggiungere Sfericità per filtrare gli oggetti non sferici. Fate clic sul pulsante Duplica (Duplicate ) per copiare la nuova superficie.
   4. Fare clic sul pulsante Statistiche , quindi fare clic sul pulsante Generale ; il software presenterà il numero di glomeruli come numero totale di superficie.
2. Volume dei glomeruli
   1. Create una superficie dei glomeruli come sopra.
   2. Una volta completata la superficie, fare clic sul pulsante Selezione per selezionare gli oggetti di destinazione e presentare il volume di ogni oggetto. Fare clic sul pulsante Salva ed esportare le statistiche in un foglio di calcolo per ulteriori analisi.
3. Volume della fetta o del rene intero
   1. Importazione di immagini di grandi dimensioni (microscopia confocale) o di immagini cucite (microscopia a foglio luminoso) nel software di analisi delle immagini.
   2. Aprire i file nel software di analisi delle immagini. Fare clic sul pulsante Superficie per creare una nuova superficie. Segui la guida nella parte in basso a sinistra dello schermo.
      1. Fare clic sul pulsante Avanti (pulsante freccia destra) senza spuntare.
      2. Selezionare la casella prima dell'opzione Arrotonda e immettere un numero appropriato (ad esempio, 50) per controllare i dettagli della superficie. Selezionare Intensità assoluta in Soglia. Fare clic sul pulsante Avanti .
      3. Regolare la superficie fino a coprire l'intero tessuto e fare clic sul pulsante Avanti . Fare clic sul pulsante Avanti per creare la superficie.
   3. Fare clic sul pulsante Selezione per selezionare la superficie dell'intero tessuto e presentare il volume del tessuto. Fai clic sul pulsante Salva per esportare le statistiche in un foglio di calcolo.

Risultati

Questo studio fornisce un metodo semplice ed efficiente per etichettare e analizzare i glomeruli nei reni dei topi.

I glomeruli (vasi sanguigni) possono essere ben marcati mediante iniezione intravascolare di FITC-destrano. Dopo il processo di eliminazione, il rene è diventato trasparente (Figura 1A) e i glomeruli hanno potuto essere osservati chiaramente utilizzando la microscopia a foglio ottico (Figura 1B) o la microscopia confoca...

Discussione

Le tecnologie di pulizia dei tessuti possono essere classificate in 3 o 4 gruppi: 29,30,31. La pulizia dei tessuti a base di solventi organici (ad es. DISCO e PEGASOS), la pulizia dei tessuti a base acquosa (ad es. CUBIC) e la pulizia dei tessuti con incorporazione di idrogel (ad es. CLARITY) sono state tutte applicate nella pulizia dei reni 25,26,28,32.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent