АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании представлен простой в использовании, полный и простой набор методов для маркировки и анализа клубочков из почек мышей, очищенных с помощью CUBIC. Такие данные, как количество и объем клубочков, могут быть легко и надежно получены с помощью флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана, флуоресцентной микроскопии со световым листом (LSFM) или обычной конфокальной микроскопии и программного обеспечения, такого как Imaris.

Аннотация

Клубочки являются основными единицами в почках; Следовательно, изучение клубочков имеет решающее значение для понимания функции почек и патологии. Биологическая визуализация предоставляет интуитивно понятную информацию; Таким образом, большое значение имеет маркировка и наблюдение за клубочками. Однако используемые в настоящее время методы наблюдения клубочков требуют сложных операций, и результаты могут потерять детали меток или трехмерную (3D) информацию. Технология очистки тканей с четкой, беспрепятственной визуализацией мозга и вычислительным анализом (CUBIC) широко используется в почечных исследованиях, обеспечивая более точное обнаружение и большую глубину обнаружения. Мы обнаружили, что клубочки мышей могут быть быстро и эффективно помечены путем инъекции в хвостовую вену среднемолекулярного FITC-декстрана с последующим методом очистки CUBIC. Очищенная почка мыши может быть отсканирована с помощью светового микроскопа (или конфокального микроскопа при разрезе), чтобы получить трехмерные изображения всех клубочков во всей почке. Обработанные с помощью соответствующего программного обеспечения, сигналы клубочков могут быть легко оцифрованы и дополнительно проанализированы для измерения количества, объема и частоты клубочков.

Введение

Количество и объем клубочков очень важны для диагностики и лечения различных заболеваний почек 1,2,3,4,5. Золотым стандартом оценки числа клубочков является комбинация физического диссектора и фракционатора. Однако этот метод требует специальных реагентов и оборудования, что делает его медленным и дорогим 6,7,8,9. Биопсия дает много информации, но очевидно, что этот метод подходит только для приблизительных оценок10,11. Технологии медицинской визуализации, в том числе магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ) и рентгенография, также широко используются при выявлении клубочков 12,13,14,15, но такие технологии требуют громоздких инструментов. Новые методы, такие как масс-спектрометр16 с матричной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) или метод толстых и тонких срезов17, также используются для обнаружения клубочков, хотя они остаются утомительными и трудоемкими.

С помощью технологий прозрачности можно наблюдать более глубокие глубины и получать более богатую и полную информацию из толстых тканей или даже целых органов 18,19,20,21,22,23. Поэтому технологии прозрачности широко используются в исследованиях почек24. Также участвуют наблюдение и обнаружение клубочков в очищенных почках. Однако в этих опубликованных статьях либо лишь вскользь упоминалось о обнаружении клубочков25, либо использовались труднодостижимые методы маркировки, такие как трансгенные животные26, самостоятельно производимые красители13 или инкубация высококонцентрированных антител27 для маркировки клубочков. Кроме того, несмотря на то, что в исследованиях анализировались клубочки в очищенных почках, анализы всегда были ограничены13 или основывались на алгоритмах анализа, установленных самими авторами26.

Ранее мы продемонстрировали более удобный способ маркировки клубочков в почках мышей28. Используя Imaris, мы обнаружили, что количество, частота и объем клубочков могут быть быстро получены. Таким образом, здесь мы представляем более доступный, полный и упрощенный набор методов для маркировки и анализа клубочков почек мышей.

протокол

В исследовании использовали взрослых мышей C57BL/6 (6-недельный возраст, 25-30 г). Все процедуры были выполнены в соответствии с местными правилами благополучия животных и экспериментальной этики. Исследование было одобрено Комитетом по этике биомедицинских исследований Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета.

1. Маркировка клубочков и подготовка тканей

  1. Маркировка клубочков
    1. Растворите FITC-декстран (10 мг) в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) в соотношении 1:1 (1 мг: 1 мл) для приготовления рабочего зондового раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
    2. Поместите мышь C57 в фиксатор вен хвоста мыши. Смочите марлю горячей водой, оберните марлей среднюю часть мышиного хвоста и прогревайте хвост в течение 1 минуты.
    3. Протрите хвост мыши 75% этиловым спиртом до тех пор, пока не станут видны левая и правая хвостовые вены.
    4. Наберите 100 мкл рабочего зондового раствора инсулиновым шприцем объемом 1 мл и медленно введите раствор в хвостовую вену мыши.
    5. После инъекции дайте раствору зонда циркулировать в течение 30 минут. Позвольте мышам свободно перемещаться в клетках.
    6. После достижения достаточного кровообращения мышей глубоко обезболивают внутрибрюшинным введением пентобарбитала натрия (1%, 60-80 мкг/кг).
  2. Забор и фиксация почки
    1. Прикрепите мышей под наркозом к анатомической пластине в положении лежа на спине. Закрепите их лапы медицинским скотчем.
    2. После подготовки кожи усыпляют мышей смертельной дозой пентобарбитала натрия (1%, 10 мг/кг).
    3. Сделайте разрез по средней линии живота, чтобы обнажить брюшную полость.
    4. Вскрыть почки и удалить их скальпелем и ножницами в вытяжном шкафу. Осторожно удалите почечную оболочку.
    5. Соберите почки и зафиксируйте их в 4% параформальдегиде (PFA) при температуре 4 °C на ночь.
    6. Промывают образцы ПБС три раза по 1 ч каждый при встряхивании при комнатной температуре (RT).
    7. Подготовьте почку к микроскопии.
      1. Нарежьте почку для конфокальной микроскопии: Нарежьте почку на ломтики толщиной 1 мм, используя матрицу мозга (сталь 1 мм, 40-75 г), чтобы стандартизировать толщину среза. Переложите ломтики в 4% PFA и продолжайте фиксацию при 4 °C в течение ночи.
      2. Целая почка для светолистовой микроскопии: Фиксируют почки в 4% PFA при 4 °C в течение 48 ч.

2. Клиринг

  1. Приготовление реагента
    1. Приготовьте реагент CUBIC-L, смешав 10% (масс./масс.) N-бутилдиэтаноламин, 10% (масс./массу) Triton X-100 и 80% ddH2O.
    2. Приготовьте реагент CUBIC-R, смешав 45% (масс./масс.) антипирина, 30% (масс./массу) никотинамида, 0,5% (об./об.) N-бутилдиэтаноламин и 24,5% ddH2O. Убедитесь, что раствор имеет рН 9,6-9,8 и показатель преломления (RI) 1,522.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CUBIC-L используется для расщепления, а CUBIC-R используется для согласования показателя преломления.
  2. Процедура клиринга
    1. Соберите образцы почек в центрифужную пробирку объемом 50 мл, а затем очистите их в CUBIC-L при встряхивании при 60 об/мин при 37 °C. Заменяйте CUBIC-L каждые 4 ч (для срезов почек) или каждые 24 ч (для всей почки) до достижения удовлетворительной оптической прозрачности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает 1 день для срезов почки и 5 дней для целой почки.
    2. Промывают образцы три раза в ПБС с легким встряхиванием при РТ в течение 1 ч каждый.
    3. Нанесите CUBIC-R на образцы, встряхивая образцы при 37 °C, 60 об/мин в течение 6 ч.
    4. Наблюдайте за очищенными образцами непосредственно или храните их в черных пробирках, наполненных CUBIC-R в RT, в течение 1 недели.

3. Получение изображения

  1. Конфокальная визуализация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте срезанные образцы почек с помощью конфокальной микроскопии (линзы: объектив Plan Apo λ 4×/0,2 N1 или объектив Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Получение больших изображений (например, 6052 мкм x 6052 мкм для среза почки) с помощью z-стеков.
    1. Включите конфокальный микроскоп в следующей последовательности: мощность лазера, переключатель управления конфокальным микроскопом, компьютер, микроскоп и конфокальное оборудование. После запуска самодиагностики включите конфокальное программное обеспечение.
    2. Выберите подходящий объектив. Извлеките образец из реагента CUBIC-R, поместите его в конфокальную чашку и накройте крышкой, чтобы предотвратить высыхание реагента CUBIC-R.
    3. Переместите образец в середину поля зрения и отрегулируйте фокальную плоскость до тех пор, пока он не окажется в фокусе.
    4. Примените 3D-реконструкцию (шаг 3.1.4.1) и реконструкцию большого изображения (шаги 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. 3D-реконструкция (конфокальная): переключение плоскости масштабирования в одном направлении до тех пор, пока флуоресценция не будет видна; Эта позиция определяется как вершина. Затем переключите плоскость зума в противоположном направлении, пока флуоресценция не исчезнет; Это положение определяется как дно. Нажмите кнопку «Выполнить » в правом нижнем углу диалогового окна, чтобы начать сканирование.
      2. Реконструкция большого изображения (конфокальная): переместите поле зрения в середину образца и установите текущее положение в качестве центра. Выберите поле зрения 2 x 2.
      3. В многофункциональном интерфейсе ND выберите стек Z для реконструкции больших изображений и задайте различные параметры на панели. Затем нажмите кнопку Run butto n, чтобы начать сканирование.
  2. Визуализация световой листовой флуоресцентной микроскопии (LSFM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте почки целиком с помощью светолистового флуоресцентного микроскопа (объектив: объектив EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (средний n = 1,529)).
    1. Прикрепление образца (LSFM):
      1. Приклейте прозрачную почку к адаптеру для фиксации образца и подождите, пока почка прочно закрепится.
      2. Замочите почку в контейнере для образцов и вставьте контейнер для образцов в систему микроскопа. Закройте люк.
    2. Наблюдение и сканирование (LSFM):
      1. В интерфейсе Locate (Местоположение ) переместите образец в подходящую позицию для наблюдения. Переключитесь на интерфейс Acquisition , установите оптический путь, выберите лазер 488 нм, LBF 405/488/561/640, блок фильтра оптического расщепления SBS LP 490, выберите Camera 2 и измените псевдоцвет на зеленый.
      2. Введите значение Смещение по оси Z влево/вправо , записанное ранее в подменю Канал . Выберите наименьший зум (0,36) и настройте его для максимальной четкости.
    3. Найдите границу X\Y и диапазон Z всего органа. Отрегулируйте интенсивность лазера и время экспозиции (желательно менее 10 мс) и нажмите кнопку «Выполнить », чтобы начать.
    4. Если ткань слишком большая, объедините два или более изображений с помощью сшивания изображений. Откройте отснятый файл с помощью программного обеспечения для микроскопии (в данном случае ZEISS ZEN 3.7). Выберите Метод обработки > > Сшивание > параметр Метод > Применить для завершения сшивания изображений.

4. Обработка и количественная оценка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте стеки изображений с помощью программного обеспечения Imaris (анализ изображений), используя функцию Surface для маркировки клубочков и выполнения анализа.

  1. Граф клубочков
    1. Импортируйте большие изображения (конфокальная микроскопия) или сшитые изображения (световая микроскопия) в программное обеспечение для анализа изображений.
    2. Откройте файлы в программном обеспечении для анализа изображений. Нажмите кнопку "Поверхность ", чтобы создать новое покрытие. Следуйте инструкциям в левой нижней части экрана.
      1. Нажмите кнопку «Далее » (кнопка со стрелкой вправо), ничего не отмечая.
      2. Поставьте галочку напротив опции Сглаживание и введите соответствующее число (например, 14.5) для управления детализацией Покрытия. Выберите «Вычитание фона » в поле «Пороговое значение » и заполните поле приблизительным средним диаметром клубочков. Нажмите кнопку Далее .
      3. При необходимости отрегулируйте и нажмите кнопку «Далее ». Выберите нужный диапазон и нажмите кнопку Далее , чтобы создать Покрытие.
    3. Нажмите кнопку «Фильтр», затем кнопку «Добавить», чтобы добавить «Сферичность» для фильтрации несферических объектов. Нажмите кнопку "Дублировать", чтобы скопировать это новое покрытие.
    4. Нажмите кнопку «Статистика », затем нажмите кнопку «Общие »; программное обеспечение представит количество клубочков в виде общего количества поверхностей.
  2. Объем клубочков
    1. Создайте поверхность клубочков, как указано выше.
    2. Когда Покрытие будет готово, нажмите кнопку Выделения , чтобы выбрать целевые объекты и представить объем каждого объекта. Нажмите кнопку «Сохранить » и экспортируйте статистику в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
  3. Объем среза или целой почки
    1. Импортируйте большие изображения (конфокальная микроскопия) или сшитые изображения (световая микроскопия) в программное обеспечение для анализа изображений.
    2. Откройте файлы в программном обеспечении для анализа изображений. Нажмите кнопку "Поверхность ", чтобы создать новое покрытие. Следуйте инструкциям в левой нижней части экрана.
      1. Нажмите кнопку «Далее » (кнопка со стрелкой вправо) без галочки.
      2. Поставьте галочку напротив опции Сглаживание и введите соответствующее число (например, 50) для управления детализацией Покрытия. Выберите Абсолютная интенсивность в пороговом значении. Нажмите кнопку Далее .
      3. Отрегулируйте Поверхность до тех пор, пока она не покроет всю ткань, и нажмите кнопку Далее . Нажмите кнопку "Далее " для создания покрытия.
    3. Нажмите кнопку Выделение , чтобы выбрать Поверхность всей ткани и представить объем ткани. Нажмите кнопку Сохранить , чтобы экспортировать статистику в электронную таблицу.

Результаты

Это исследование представляет собой простой и эффективный метод маркировки и анализа клубочков в почках мышей.

Клубочки (кровеносные сосуды) могут быть хорошо помечены внутрисосудистым введением FITC-Dextran. После процесса очищения почка становилась прозрачной (

Обсуждение

Тканевые очистительные технологии можно разделить на 3 или 4 группы 29,30,31. Очищение тканей на основе органических растворителей (например, DISCO и PEGASOS), очищение тканей на водной основе (например, CUBIC) и очистка тканей с внедрением гидрогеля...

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (82204951) и Сычуаньской научно-технической программы (2020JDRC0102).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4% PFABiosharp7007171800Fixation reaagen
502 Glue Deli7146For fixing the kidney to the sample fixing adapter 
AntipyrineAladdinA110660Clearing reagent
Brain MatrixRWD Life Science1mm 40-75Tissue slicing
Confocal microscopyNikonA1plusImage acquisition
FITC-DextranSigma-AldrichFD150SLabeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy ZeissLight sheet 7 Image acquisition
MiceEnsiweierAdult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g) 
N-ButyldiethanolamineAladdinB299095Clearing reagent
NicotinamideAladdinN105042Clearing reagent
Pentobarbital NatriumsalzSigma-AldrichP3761
Tail vein fixatorJINUOTAIJNT-FS35Fix the mouse for vail injection
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Clearing reagent

Ссылки

  1. Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  2. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  4. Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
  5. Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
  6. Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
  7. Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
  8. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  9. Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
  10. Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  11. Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
  12. Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
  13. Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521 (2019).
  14. Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  15. Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
  16. Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
  17. Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
  18. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  20. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
  21. Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
  22. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  23. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  24. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  25. Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008 (2022).
  26. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  27. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  28. Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042 (2023).
  29. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  30. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
  31. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  32. Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
  33. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены