Une méthode efficace et rapide pour l’étiquetage et l’analyse des glomérules de souris

Résumé

Cette étude présente un ensemble de méthodes simples et faciles à utiliser pour marquer et analyser les glomérules des reins de souris nettoyés par CUBIC. Des données telles que le nombre et le volume du glomérule peuvent être obtenues facilement et de manière fiable à l’aide de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-Dextran, de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) ou de la microscopie confocale commune et de logiciels tels qu’Imaris.

Résumé

Les glomérules sont des unités fondamentales dans le rein ; Par conséquent, l’étude des glomérules est essentielle pour comprendre la fonction rénale et la pathologie. L’imagerie biologique fournit des informations intuitives ; Il est donc d’une grande importance d’étiqueter et d’observer les glomérules. Cependant, les méthodes d’observation des glomérules actuellement utilisées nécessitent des opérations compliquées, et les résultats peuvent perdre des détails d’étiquette ou des informations tridimensionnelles (3D). La technologie d’élimination des tissus (CUBIC) a été largement utilisée dans la recherche rénale, permettant une détection plus précise et une profondeur de détection plus profonde. Nous avons constaté que les glomérules de souris peuvent être marqués rapidement et efficacement par injection dans la veine caudale de FITC-Dextran de poids moléculaire moyen, suivie de la méthode de nettoyage CUBIC. Le rein de souris nettoyé pourrait être scanné par un microscope à feuille de lumière (ou un microscope confocal lorsqu’il est tranché) pour obtenir des empilements d’images tridimensionnelles de tous les glomérules dans l’ensemble du rein. Traités à l’aide d’un logiciel approprié, les signaux des glomérules pourraient être facilement numérisés et analysés pour mesurer le nombre, le volume et la fréquence des glomérules.

Introduction

Le nombre et le volume des glomérules sont très importants pour le diagnostic et le traitement de diverses maladies rénales 1,2,3,4,5. L’étalon-or de l’estimation du nombre de glomérules est la combinaison dissecteur/fractionneur physique. Cependant, cette méthode nécessite des réactifs et des équipements spéciaux, ce qui la rend lente et coûteuse 6,7,8,9. La biopsie fournit une mine d’informations, mais il est évident que cette méthode ne convient qu’à des estimations approximatives^10,11. Les technologies d’imagerie médicale, y compris l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomodensitométrie (TDM) et les rayons X, sont également largement utilisées dans la détection glomérulaire 12,13,14,15, mais ces technologies nécessitent des instruments encombrants. De nouvelles méthodes, telles que le spectromètre de masse imageur par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)¹⁶ ou la méthode des sections épaisses et minces¹⁷, ont également été utilisées pour la détection glomérulaire, bien qu’elles restent fastidieuses et laborieuses.

À l’aide des technologies de transparence, il est possible d’observer des profondeurs plus profondes et d’obtenir des informations plus riches et plus complètes à partir de tissus épais ou même d’organes entiers 18,19,20,21,22,23. Par conséquent, les technologies de transparence ont été largement utilisées dans la recherche sur les reins²⁴. L’observation et la détection des glomérules dans les reins dégagés sont également impliquées. Cependant, ces articles publiés ne faisaient que brièvement référence à la détection glomérulaire²⁵ ou utilisaient des méthodes de marquage difficiles à réaliser telles que des animaux transgéniques²⁶, des colorants autoproduits¹³ ou l’incubation d’anticorps à haute concentration²⁷ pour marquer les glomérules. De plus, bien que des études aient analysé des glomérules dans des reins dégagés, les analyses étaient toujours limitées¹³ ou reposaient sur des algorithmes d’analyse établis par les auteurs eux-mêmes²⁶.

Nous avons déjà démontré un moyen plus pratique d’étiqueter les glomérules dans les reins de souris²⁸. En utilisant Imaris, nous avons constaté que le nombre, la fréquence et le volume des glomérules pouvaient être obtenus rapidement. Ainsi, nous présentons ici un ensemble de méthodes plus accessibles, complètes et simplifiées pour étiqueter et analyser les glomérules des reins de souris.

Protocole

Des souris C57BL/6 adultes (âgées de 6 semaines, 25-30 g) ont été utilisées dans cette étude. Toutes les procédures ont été effectuées dans le respect des réglementations locales en matière de bien-être animal et d’éthique expérimentale. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche biomédicale de l’hôpital de l’ouest de la Chine de l’Université du Sichuan.

1. Marquage des glomérules et préparation des tissus

1. Marquage des glomérules
   1. Dissoudre le FITC-dextran (10 mg) dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un rapport de 1 :1 (1 mg : 1 mL) pour préparer la solution de sonde de travail.
      REMARQUE : La solution de travail peut être conservée à 4 °C pendant 1 mois.
   2. Placez la souris C57 dans un fixateur de veine de queue de souris. Mouillez la gaze avec de l’eau chaude, enroulez la gaze autour de la partie médiane de la queue de la souris et réchauffez la queue pendant 1 min.
   3. Essuyez la queue de la souris avec de l’éthanol à 75 % jusqu’à ce que les veines gauche et droite de la queue soient visibles.
   4. Prélever 100 μL de la solution de sonde de travail à l’aide d’une seringue à insuline de 1 mL et injecter lentement la solution dans la veine de la queue de la souris.
   5. Après l’injection, laisser circuler la solution de sonde pendant 30 min. Laissez les souris se déplacer librement dans leurs cages.
   6. Une fois que la circulation est suffisante, anesthésier en profondeur les souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (1%, 60-80 μg/kg).
2. Prélèvement et fixation des reins
   1. Fixez les souris anesthésiées à la plaque anatomique en position couchée sur le dos. Fixez leurs pattes avec du ruban adhésif médical.
   2. Après la préparation de la peau, euthanasier les souris avec une dose létale de pentobarbital sodique (1%, 10 mg / kg).
   3. Faites une incision abdominale médiane pour exposer la cavité abdominale.
   4. Révéler les rognons et les retirer à l’aide d’un scalpel et de ciseaux dans la hotte. Retirez délicatement l’enveloppe rénale.
   5. Prélever les reins et les fixer dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % à 4 °C pendant la nuit.
   6. Laver les échantillons avec du PBS trois fois 1 h chacune en agitant à température ambiante (RT).
   7. Préparez le rein pour la microscopie.
      1. Trancher le rein pour la microscopie confocale : Couper le rein en tranches de 1 mm d’épaisseur à l’aide de la matrice cérébrale (acier de 1 mm, 40-75 g) pour standardiser l’épaisseur de la tranche. Transvaser les tranches dans du PFA à 4 % et poursuivre la fixation à 4 °C pendant la nuit.
      2. Rein entier pour la microscopie à feuille de lumière : Fixer les reins dans de l’APF à 4 % à 4 °C pendant 48 h.

2. Dégagement

1. Préparation des réactifs
   1. Préparer le réactif CUBIC-L en mélangeant 10 % (poids/poids) de N-butyldiéthanolamine, 10 % (poids/poids) de Triton X-100 et 80 % de ddH₂O.
   2. Préparer le réactif CUBIC-R en mélangeant 45 % (poids/poids) d’antipyrine, 30 % (poids/poids) de nicotinamide, 0,5 % (vol/vol) de N-butyldiéthanolamine et 24,5 % de ddH₂O. Assurez-vous que la solution a un pH de 9,6 à 9,8 et un indice de réfraction (AR) de 1,522.
      REMARQUE : CUBIC-L est utilisé pour la délipidation et CUBIC-R est utilisé pour l’adaptation de l’indice de réfraction.
2. Procédure de compensation
   1. Prélever les échantillons de rein dans un tube à centrifuger de 50 mL, puis les nettoyer dans CUBIC-L en agitant à 60 tr/min à 37 °C. Remplacer CUBIC-L toutes les 4 h (pour les tranches de rein) ou toutes les 24 h (pour un rein entier) jusqu’à l’obtention d’une transparence optique satisfaisante.
      REMARQUE : Ce processus prend 1 jour pour les tranches de rein et 5 jours pour un rein entier.
   2. Lavez les échantillons trois fois dans du PBS en agitant doucement à RT pendant 1 h chacun.
   3. Appliquer CUBIC-R sur les échantillons en agitant les échantillons à 37 °C, 60 tr/min pendant 6 h.
   4. Observez directement les échantillons dégagés ou stockez-les dans des tubes noirs remplis de CUBIC-R à RT pendant 1 semaine.

3. Acquisition d’images

1. Imagerie confocale
   REMARQUE : Imagez les échantillons de rein tranchés à l’aide d’une microscopie confocale (lentilles : un objectif Plan Apo λ 4×/0,2 N1 ou un objectif Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Capturez de grandes images (par exemple, 6052 μm x 6052 μm pour la tranche de rein) avec des piles z.
   1. Mettez le microscope confocal sous tension dans l’ordre suivant : alimentation laser, commutateur de commande confocale, ordinateur, microscope et matériel confocal. Après avoir exécuté l’autotest, allumez le logiciel confocal.
   2. Sélectionnez l’objectif approprié. Retirez l’échantillon du réactif CUBIC-R, placez-le dans la boîte confocale et couvrez-le pour éviter que le réactif CUBIC-R ne se dessèche.
   3. Déplacez l’échantillon vers le milieu du champ de vision et ajustez le plan focal jusqu’à ce qu’il soit net.
   4. Appliquez la reconstruction 3D (étape 3.1.4.1) et la reconstruction d’images de grande taille (étapes 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. Reconstruction 3D (confocale) : basculez le plan de zoom dans une direction jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit visible ; Cette position est définie comme le sommet. Ensuite, basculez le plan de zoom dans la direction opposée jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit visible ; Cette position est définie comme le bas. Cliquez sur le bouton Exécuter dans le coin inférieur droit de la boîte de dialogue pour lancer l’analyse.
      2. Reconstruction d’une grande image (confocale) : déplacez le champ de vision vers le milieu de l’échantillon et définissez la position actuelle comme centre. Sélectionnez un champ de vision 2 x 2.
      3. Dans l’interface multifonction ND, sélectionnez la pile Z pour reconstruire des images de grande taille et définir différentes options dans le panneau. Appuyez ensuite sur la touche Exécuter mais à n pour lancer l’analyse.
2. Imagerie par microscopie à fluorescence à nappe de lumière (LSFM)
   REMARQUE : Imagez l’ensemble des reins à l’aide d’un microscope à fluorescence à feuille de lumière (objectif : EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (Medium n = 1,529)).
   1. Exemple de fixation (LSFM) :
      1. Collez le rein transparent sur l’adaptateur de fixation de l’échantillon et attendez que le rein soit fermement fixé.
      2. Faites tremper le rein dans le bac à échantillons et poussez le bac à échantillons dans le système de microscope. Fermez la trappe.
   2. Observer et balayer (LSFM) :
      1. Dans l’interface Localiser , déplacez l’échantillon vers une position d’observation appropriée. Passez à l’interface d’acquisition , définissez le chemin optique, sélectionnez le laser 488 nm, LBF 405/488/561/640, bloc de filtre à séparation optique SBS LP 490, sélectionnez Caméra 2 et changez la pseudo-couleur en vert.
      2. Renseignez la valeur Décalage Z gauche/droite enregistrée précédemment dans le sous-menu Canal . Sélectionnez le zoom le plus petit (0,36) et ajustez-le pour une clarté maximale.
   3. Trouvez la limite X\Y et l’intervalle Z de l’orgue entier. Ajustez l’intensité du laser et le temps d’exposition (de préférence inférieur à 10 ms), puis cliquez sur Exécuter pour commencer.
   4. Si le tissu est trop grand, fusionnez deux images ou plus à l’aide de l’assemblage d’images. Ouvrez le fichier capturé à l’aide du logiciel de microscopie (ici, ZEISS ZEN 3.7). Sélectionnez Méthode de traitement > > Paramètre Méthode d’assemblage > > Appliquer pour terminer l’assemblage d’images.

4. Traitement et quantification des données

REMARQUE : Traitez les piles d’images avec le logiciel Imaris (analyse d’images), en utilisant la fonction Surface pour étiqueter les glomérules et effectuer l’analyse.

1. Comte de glomérules
   1. Importez des images de grande taille (microscopie confocale) ou des images assemblées (microscopie à nappe de lumière) dans le logiciel d’analyse d’images.
   2. Ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse d’images. Cliquez sur le bouton Surface pour créer une nouvelle Surface. Suivez le guide en bas à gauche de l’écran.
      1. Cliquez sur le bouton Suivant (flèche vers la droite) sans rien cocher.
      2. Cochez la case avant l’option Lissage et entrez un nombre approprié (par exemple, 14,5) pour contrôler les détails de la surface. Sélectionnez Soustraction d’arrière-plan dans Seuillage et remplissez la zone avec le diamètre moyen approximatif des glomérules. Cliquez sur le bouton Suivant .
      3. Ajustez si nécessaire, puis cliquez sur le bouton Suivant . Sélectionnez la plage appropriée et cliquez sur le bouton Suivant pour créer une surface.
   3. Cliquez sur Filtrer, puis sur le bouton Ajouter pour ajouter de la sphéricité afin de filtrer les objets non sphériques. Cliquez sur le bouton Dupliquer pour copier cette nouvelle surface.
   4. Cliquez sur le bouton Statistiques , puis sur le bouton Global . le logiciel présentera le nombre de glomérules comme le nombre total de surfaces.
2. Volume des glomérules
   1. Créez une surface des glomérules comme ci-dessus.
   2. Une fois la surface terminée, cliquez sur le bouton Sélection pour sélectionner les objets cibles et présenter le volume de chaque objet. Cliquez sur le bouton Enregistrer et exportez les statistiques vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.
3. Volume de la tranche ou du rein entier
   1. Importez des images de grande taille (microscopie confocale) ou des images assemblées (microscopie à nappe de lumière) dans le logiciel d’analyse d’images.
   2. Ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse d’images. Cliquez sur le bouton Surface pour créer une nouvelle Surface. Suivez le guide en bas à gauche de l’écran.
      1. Cliquez sur le bouton Suivant (flèche droite) sans le cocher.
      2. Cochez la case avant l’option Lissage et entrez un nombre approprié (par exemple, 50) pour contrôler les détails de la surface. Sélectionnez Intensité absolue dans Seuillage. Cliquez sur le bouton Suivant .
      3. Ajustez la surface jusqu’à ce qu’elle recouvre l’ensemble du tissu, puis cliquez sur le bouton Suivant . Cliquez sur le bouton Suivant pour créer la surface.
   3. Cliquez sur le bouton Sélection pour sélectionner la surface de l’ensemble du tissu et présenter le volume du tissu. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour exporter les statistiques vers une feuille de calcul.

Résultats

Cette étude fournit une méthode simple et efficace pour marquer et analyser les glomérules dans les reins de souris.

Les glomérules (vaisseaux sanguins) peuvent être bien marqués par injection intravasculaire de FITC-Dextran. Après le processus de clairification, le rein est devenu transparent (Figure 1A) et les glomérules ont pu être clairement observés à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière (Figure 1B) ou de...

Discussion

Les technologies de nettoyage des tissus peuvent être classées en 3 ou 4 groupes 29,30,31. L’élimination des tissus à base de solvants organiques (p. ex., DISCO et PEGASOS), l’élimination des tissus à base d’eau (p. ex., CUBIC) et l’élimination des tissus d’enrobage d’hydrogel (p. ex., CLARITY) ont toutes été appliquées dans le nettoyage des reins 25,26,28,32.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent