Une méthode efficace et rapide pour l’étiquetage et l’analyse des glomérules de souris

Résumé

Cette étude présente un ensemble de méthodes simples et faciles à utiliser pour marquer et analyser les glomérules des reins de souris nettoyés par CUBIC. Des données telles que le nombre et le volume du glomérule peuvent être obtenues facilement et de manière fiable à l’aide de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-Dextran, de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM) ou de la microscopie confocale commune et de logiciels tels qu’Imaris.

Résumé

Les glomérules sont des unités fondamentales dans le rein ; Par conséquent, l’étude des glomérules est essentielle pour comprendre la fonction rénale et la pathologie. L’imagerie biologique fournit des informations intuitives ; Il est donc d’une grande importance d’étiqueter et d’observer les glomérules. Cependant, les méthodes d’observation des glomérules actuellement utilisées nécessitent des opérations compliquées, et les résultats peuvent perdre des détails d’étiquette ou des informations tridimensionnelles (3D). La technologie d’élimination des tissus (CUBIC) a été largement utilisée dans la recherche rénale, permettant une détection plus précise et une profondeur de détection plus profonde. Nous avons constaté que les glomérules de souris peuvent être marqués rapidement et efficacement par injection dans la veine caudale de FITC-Dextran de poids moléculaire moyen, suivie de la méthode de nettoyage CUBIC. Le rein de souris nettoyé pourrait être scanné par un microscope à feuille de lumière (ou un microscope confocal lorsqu’il est tranché) pour obtenir des empilements d’images tridimensionnelles de tous les glomérules dans l’ensemble du rein. Traités à l’aide d’un logiciel approprié, les signaux des glomérules pourraient être facilement numérisés et analysés pour mesurer le nombre, le volume et la fréquence des glomérules.

Introduction

Le nombre et le volume des glomérules sont très importants pour le diagnostic et le traitement de diverses maladies rénales 1,2,3,4,5. L’étalon-or de l’estimation du nombre de glomérules est la combinaison dissecteur/fractionneur physique. Cependant, cette méthode nécessite des réactifs et des équipements spéciaux, ce qui la rend lente et coûteuse 6,7,8,9. La biopsie fournit une m....

Protocole

Des souris C57BL/6 adultes (âgées de 6 semaines, 25-30 g) ont été utilisées dans cette étude. Toutes les procédures ont été effectuées dans le respect des réglementations locales en matière de bien-être animal et d’éthique expérimentale. L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche biomédicale de l’hôpital de l’ouest de la Chine de l’Université du Sichuan.

1. Marquage des glomérules et préparation des tissus

1. Marquage des glomérules
   1. Dissoudre le FITC-dextran (10 mg) dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un rapport de 1 :1 (1 mg : 1 mL) pour préparer la solution de sonde....

Discussion

Les technologies de nettoyage des tissus peuvent être classées en 3 ou 4 groupes 29,30,31. L’élimination des tissus à base de solvants organiques (p. ex., DISCO et PEGASOS), l’élimination des tissus à base d’eau (p. ex., CUBIC) et l’élimination des tissus d’enrobage d’hydrogel (p. ex., CLARITY) ont toutes été appliquées dans le nettoyage des reins 25,26,28,32.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent