マウス糸球体の標識と分析のための効率的で迅速な方法

要約

この研究は、CUBIC透明マウス腎臓からの糸球体を標識および分析するための、使いやすく完全でシンプルな一連の方法を提示します。糸球体数や体積などのデータは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)、または一般的な共焦点顕微鏡とImarisなどのソフトウェアを使用して簡単かつ確実に取得できます。

要約

糸球体は腎臓の基本単位です。したがって、糸球体を研究することは、腎機能と病理学を理解する上で極めて重要です。生物学的イメージングは直感的な情報を提供します。したがって、糸球体にラベルを付けて観察することは非常に重要です。しかし、現在使用されている糸球体観察法は複雑な操作を必要とし、その結果、ラベルの詳細や3次元(3D)情報が失われる可能性があります。透明で遮るもののない脳イメージングカクテルとコンピューター解析(CUBIC)組織透明化技術は、腎臓研究で広く使用されており、より正確な検出とより深い検出深さを可能にしています。マウス糸球体は、中分子量のFITC-デキストランの尾静脈注入とそれに続くCUBIC透明化法により、迅速かつ効果的に標識できることを見出しました。透明化したマウスの腎臓をライトシート顕微鏡(スライスした場合は共焦点顕微鏡)でスキャンし、腎臓全体のすべての糸球体の3次元画像スタックを得ることができた。適切なソフトウェアで処理することで、糸球体信号を簡単にデジタル化し、さらに分析して糸球体の数、体積、頻度を測定することができます。

概要

糸球体の数と量は、さまざまな腎臓病の診断と治療にとって非常に重要です^1,2,3,4,5。糸球体数推定のゴールデンスタンダードは、物理的なディセクタ/フラクショネーターの組み合わせです。ただし、この方法は特別な試薬と機器を必要とするため、時間がかかり^{、高価になります6,7,8,9}。生検は豊富な情報を提供しますが、明らかに、この方法は大まかな推定にのみ適しています^10,11。磁気共鳴画像法(MRI)、コンピュータ断層撮影法(CT)、X線などの医用画像技術も糸球体検出に広く使用されています^12,13,14,15

プロトコル

この研究では、成体C57BL / 6マウス(6週齢、25〜30 g)を使用しました。すべての手順は、動物福祉と実験倫理の地域の規制に準拠して行われました。この研究は、四川大学生物医学研究倫理委員会の華西病院によって承認されました。

1.糸球体標識と組織調製

1. 糸球体ラベリング
   1. FITC-デキストラン(10 mg)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に1:1(1 mg:1 mL)の比率で溶解し、ワーキングプローブ溶液を調製します。
      注:ワーキング溶液は4°Cで1ヶ月間保存できます。
   2. C57マウスをマウス尾静脈固定具に入れます。ガーゼをお湯で濡らし、マウスの尻尾の真ん中にガーゼを巻き付け、尻尾を1分間温めます。
   3. 左右の尾静脈が見えるまで、マウスの尾を75%エタノールで拭きます。
   4. 1 mLのインスリンシリンジで100 μLの作業プローブ溶液を吸引し、マウス尾静脈にゆっくりと溶液を注入します。
   5. 注入後、プローブ溶液を30分間循環させます。マウスがケージ内で自由に動くようにします。
   6. 十分な循環が達成されたら、ペントバルビタールナトリウム(1%、60〜80 μg / kg)の腹腔内注射によりマウスを深く麻酔します。.
2. 腎臓のサンプリングと固定
   1. 麻酔をか....

ディスカッション

組織透明化技術は、3つまたは4つのグループ^29、30、31に分類できます。有機溶媒ベースの組織透明化(DISCOやPEGASOSなど)、水性組織透明化(CUBICなど)、ハイドロゲル包埋組織透明化(CLARITYなど)はすべて、腎臓の透明化に適用されています^25,26,28,32。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent