一种高效、快速的小鼠肾小球标记和分析方法

摘要

本研究提出了一套易于使用、完整且简单的方法来标记和分析来自 CUBIC 清除的小鼠肾脏的肾小球。使用异硫氰酸荧光素 （FITC）-葡聚糖、光片荧光显微镜 （LSFM） 或常见的共聚焦显微镜和软件（如 Imaris）可以轻松可靠地获得肾小球数量和体积等数据。

摘要

肾小球是肾脏的基本单位;因此，研究肾小球对于了解肾功能和病理学至关重要。生物成像提供直观的信息;因此，标记和观察肾小球具有重要意义。然而，目前使用的肾小球观察方法需要复杂的操作，并且结果可能会丢失标签细节或三维（3D）信息。清晰、畅通无阻的脑成像鸡尾酒和计算分析（CUBIC）组织清除技术已广泛应用于肾脏研究，可实现更准确的检测和更深的检测深度。我们发现，通过尾静脉注射中等分子量的FITC-葡聚糖，然后采用CUBIC透明化方法，可以快速有效地标记小鼠肾小球。清除的小鼠肾脏可以通过光片显微镜（或切片时的共聚焦显微镜）扫描，以获得整个肾脏中所有肾小球的三维图像堆栈。使用适当的软件处理，肾小球信号可以很容易地数字化并进一步分析，以测量肾小球的数量、体积和频率。

引言

肾小球的数量和体积对于各种肾脏疾病的诊断和治疗非常重要1,2,3,4,5。肾小球数估计的黄金标准是物理解剖器/分馏器组合。然而，这种方法需要特殊的试剂和设备，使其速度慢且昂贵6,7,8,9。活检提供了丰富的信息，但显然，这种方法只适用于粗略估计^10,11。医学成像技术，包括磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）和X射线，也广泛用于肾小球检测12,13,14,15，但这些技术需要笨重的仪器。

研究方案

本研究使用成年C57BL / 6小鼠（6周龄，25-30g）。所有程序均按照当地动物福利和实验伦理法规进行。该研究已获得四川大学华西医院生物医学研究伦理委员会的批准。

1. 肾小球标记和组织制备

1. 肾小球标记
   1. 将FITC-葡聚糖（10mg）以1：1（1mg：1mL）的比例溶解在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，以制备工作探针溶液。
      注意：工作溶液可以在4°C下储存1个月。
   2. 将C57小鼠置于小鼠尾静脉固定器中。用热水润湿纱布，将纱布缠绕在老鼠尾巴的中间部分，然后将尾巴加热1分钟。
   3. 用75%乙醇擦拭鼠尾，直到左右尾静脉可见。
   4. 用 1 mL 胰岛素注射器抽取 100 μL 工作探针溶液，然后将溶液缓慢注入小鼠尾静脉。
   5. 注射后，让探针溶液循环30分钟。让老鼠在笼子里自由移动。
   6. 一旦达到足够的循环，通过腹膜内注射戊巴比妥钠（1%，60-80μg/ kg）深度麻醉小鼠。
2. 肾脏取样和固定
   1. 将麻醉的小鼠以仰卧位固定在解剖板上。用医用胶带固定他们的爪子。
   2. 皮肤制备后，用致死剂量的戊巴比妥钠（1%，10mg / kg）对小鼠实施安乐死。
   3. 做一个腹部中线切口，露出腹腔。
   4. 露出肾脏，用手术刀和剪刀在通....

讨论

组织清除技术可分为3组或4组29,30,31。有机溶剂型组织透明化（例如DISCO和PEGASOS）、水性组织透明化（例如CUBIC）和水凝胶包埋组织透明化（例如CLARITY）均已应用于肾脏透明化25,26,28,32。正如我们已经证明的那样，当肾小球（血管）.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent