Un método eficiente y rápido para etiquetar y analizar glomérulos de ratón

Resumen

Este estudio presenta un conjunto de métodos fáciles de usar, completos y simples para etiquetar y analizar glomérulos de riñones de ratón aclarados por CUBIC. Los datos como el número y el volumen del glomérulo se pueden obtener de forma fácil y fiable utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextrano, microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) o microscopía confocal común y software como Imaris.

Resumen

Los glomérulos son unidades fundamentales en el riñón; Por lo tanto, el estudio de los glomérulos es fundamental para comprender la función renal y la patología. Las imágenes biológicas proporcionan información intuitiva; Por lo tanto, es de gran importancia etiquetar y observar los glomérulos. Sin embargo, los métodos de observación de glomérulos que se utilizan actualmente requieren operaciones complicadas y los resultados pueden perder detalles de la etiqueta o información tridimensional (3D). La tecnología de limpieza de tejidos de análisis computacional (CUBIC) y cócteles de imágenes cerebrales transparentes y sin obstrucciones se ha utilizado ampliamente en la investigación renal, lo que permite una detección más precisa y una profundidad de detección más profunda. Descubrimos que los glomérulos de ratón pueden marcarse rápida y eficazmente mediante la inyección en la vena de la cola de FITC-Dextrano de peso molecular medio, seguida del método de aclaramiento CUBIC. El riñón de ratón aclarado podría escanearse con un microscopio de lámina de luz (o un microscopio confocal cuando se corta) para obtener pilas de imágenes tridimensionales de todos los glomérulos de todo el riñón. Procesadas con el software adecuado, las señales de los glomérulos podrían digitalizarse fácilmente y analizarse más a fondo para medir el número, el volumen y la frecuencia de los glomérulos.

Introducción

El número y el volumen de los glomérulos son muy importantes para el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades renales 1,2,3,4,5. El estándar de oro de la estimación del número de glomérulos es la combinación física de disector/fraccionador. Sin embargo, este método requiere reactivos y equipos especiales, lo que lo hace lento y costoso 6,7,8,9. La biopsia proporciona una gran cantidad de información, pero obviamente, este método solo es adecuado para estimaciones aproximadas^10,11. Las tecnologías de imágenes médicas, como la resonancia magnética (RM), la tomografía computarizada (TC) y los rayos X, también se utilizan ampliamente en la detección glomerular 12,13,14,15, pero estas tecnologías requieren instrumentos voluminosos. También se han utilizado nuevos métodos, como el espectrómetro de masas de imágenes de imágenes por láser asistido por matriz (MALDI)¹⁶ o el método de sección gruesa y delgada¹⁷, en la detección glomerular, aunque siguen siendo tediosos y laboriosos.

Con la ayuda de las tecnologías de transparencia, es posible observar profundidades más profundas y obtener información más rica y completa de tejidos gruesos o incluso de órganos enteros 18,19,20,21,22,23. Por lo tanto, las tecnologías de transparencia han sido ampliamente utilizadas en la investigación renal²⁴. También está implicada la observación y detección de glomérulos en los riñones aclarados. Sin embargo, estos artículos publicados solo se refirieron brevemente a la detección glomerular²⁵ o utilizaron métodos de etiquetado difíciles de lograr, como animales transgénicos²⁶, colorantes autoproducidos¹³ o incubación de anticuerpos de alta concentración²⁷ para etiquetar los glomérulos. Además, a pesar de que los estudios habían analizado glomérulos en riñones aclarados, los análisis siempre fueron limitados¹³ o se basaron en algoritmos de análisis establecidos por los propios autores²⁶.

Anteriormente hemos demostrado una forma más conveniente de etiquetar los glomérulos en riñones de ratones²⁸. Mediante el uso de Imaris, descubrimos que el recuento, la frecuencia y el volumen de los glomérulos se podían obtener rápidamente. Por lo tanto, aquí presentamos un conjunto de métodos más accesibles, completos y simplificados para etiquetar y analizar los glomérulos de los riñones de ratones.

Protocolo

En este estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6 (6 semanas de edad, 25-30 g). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales de bienestar animal y ética experimental. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Biomédica del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan.

1. Marcaje de glomérulos y preparación de tejidos

1. Etiquetado de glomérulos
   1. Disolver FITC-dextrano (10 mg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x en una proporción de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar la solución de sonda de trabajo.
      NOTA: La solución de trabajo puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes.
   2. Coloque el ratón C57 en un fijador de venas de cola de ratón. Humedece la gasa con agua caliente, envuélvela alrededor de la parte media de la cola del ratón y caliéntala durante 1 minuto.
   3. Limpie la cola del ratón con etanol al 75% hasta que las venas de la cola izquierda y derecha sean visibles.
   4. Extraiga 100 μL de la solución de la sonda de trabajo con una jeringa de insulina de 1 ml e inyecte lentamente la solución en la vena de la cola del ratón.
   5. Después de la inyección, deje que la solución de la sonda circule durante 30 minutos. Deja que los ratones se muevan libremente en sus jaulas.
   6. Una vez que se logre una circulación suficiente, anestesiar profundamente a los ratones mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (1%, 60-80 μg/kg).
2. Toma de muestras y fijación de riñón
   1. Fijar los ratones anestesiados a la placa anatómica en posición supina. Asegure sus patas con cinta médica.
   2. Después de la preparación de la piel, eutanasiar a los ratones con una dosis letal de pentobarbital sódico (1%, 10 mg/kg).
   3. Haga una incisión en la línea media del abdomen para exponer la cavidad abdominal.
   4. Revela los riñones y retíralos con un bisturí y unas tijeras en la campana extractora. Retire la envoltura renal con cuidado.
   5. Recoja los riñones y fíjelos en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C durante la noche.
   6. Lavar las muestras con PBS tres veces 1 h cada una con agitación a temperatura ambiente (RT).
   7. Preparar el riñón para la microscopía.
      1. Cortar el riñón para microscopía confocal: Cortar el riñón en rodajas de 1 mm de grosor utilizando la matriz cerebral (acero de 1 mm, 40-75 g) para estandarizar el grosor de la rebanada. Transfiera las rodajas a PFA al 4% y continúe la fijación a 4 °C durante la noche.
      2. Riñón completo para microscopía de lámina óptica: Fijar los riñones en PFA al 4% a 4 °C durante 48 h.

2. Compensación

1. Preparación de reactivos
   1. Prepare el reactivo CUBIC-L mezclando 10% (peso/peso) de N-butildietanolamina, 10% (peso/peso) Triton X-100 y 80% ddH₂O.
   2. Prepare el reactivo CUBIC-R mezclando 45% (peso/peso) de antipirina, 30% (peso/peso) de nicotinamida, 0,5% (vol/vol) de N-butildietanolamina y 24,5% ddH₂O. Asegúrese de que la solución tenga un pH de 9,6-9,8 y un índice de refracción (IR) de 1,522.
      NOTA: CUBIC-L se utiliza para la desinfección y CUBIC-R se utiliza para la coincidencia del índice de refracción.
2. Procedimiento de compensación
   1. Recoja las muestras de riñón en un tubo de centrífuga de 50 ml y luego límpielas en CUBIC-L agitando a 60 rpm a 37 °C. Reemplace CUBIC-L cada 4 h (para cortes de riñón) o cada 24 h (para un riñón completo) hasta lograr una transparencia óptica satisfactoria.
      NOTA: Este proceso tarda 1 día para los cortes de riñón y 5 días para un riñón completo.
   2. Lave las muestras tres veces en PBS agitando suavemente a RT durante 1 h cada una.
   3. Aplicar CUBIC-R a las muestras, agitando las muestras a 37 °C, 60 rpm durante 6 h.
   4. Observe las muestras aclaradas directamente o guárdelas en tubos negros llenos de CUBIC-R en RT durante 1 semana.

3. Adquisición de imágenes

1. Imágenes confocales
   NOTA: Tome imágenes de las muestras de riñón cortadas con microscopía confocal (lentes: un objetivo Plan Apo λ 4×/0.2 N1 o un objetivo Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1). Capture imágenes grandes (p. ej., 6052 μm x 6052 μm para el corte de riñón) con pilas z.
   1. Encienda el microscopio confocal en la siguiente secuencia: potencia láser, interruptor de control confocal, computadora, microscopio y hardware confocal. Después de ejecutar la autocomprobación, encienda el software confocal.
   2. Seleccione la lente adecuada. Retire la muestra del reactivo CUBIC-R, colóquela en la placa confocal y cúbrala para evitar que el reactivo CUBIC-R se seque.
   3. Mueva la muestra al centro del campo de visión y ajuste el plano focal hasta que esté enfocada.
   4. Aplique la reconstrucción 3D (paso 3.1.4.1) y la reconstrucción de imágenes grandes (pasos 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. Reconstrucción 3D (confocal): Cambie el plano del zoom en una dirección hasta que no se vea fluorescencia; Esta posición se define como la parte superior. Luego, cambie el plano de zoom en la dirección opuesta hasta que no se vea fluorescencia; Esta posición se define como la parte inferior. Haga clic en el botón Ejecutar en la esquina inferior derecha del cuadro de diálogo para iniciar el análisis.
      2. Reconstrucción de imagen grande (confocal): mueva el campo de visión al centro de la muestra y establezca la posición actual como centro. Seleccione un campo de visión de 2 x 2.
      3. En la interfaz multifunción ND, seleccione la pila Z para reconstruir imágenes grandes y establezca diferentes opciones en el panel. A continuación, pulse el botón Ejecutar para iniciar el escaneo.
2. Imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM)
   NOTA: Tome imágenes de los riñones enteros con un microscopio de fluorescencia de lámina de luz (lente: objetivo EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (medio n = 1.529)).
   1. Adjuntar muestras (LSFM):
      1. Pegue el riñón transparente al adaptador de fijación de muestras y espere hasta que el riñón esté firmemente unido.
      2. Remoje el riñón en el recipiente de muestras y empuje el recipiente de muestras en el sistema de microscopio. Cierre la escotilla.
   2. Observar y escanear (LSFM):
      1. En la interfaz Localizar , mueva la muestra a una posición de observación adecuada. Cambie a la interfaz de adquisición , configure la ruta óptica, seleccione láser de 488 nm, LBF 405/488/561/640, bloque de filtro de división óptica SBS LP 490, seleccione Cámara 2 y cambie el pseudocolor a verde.
      2. Rellene el valor de Desplazamiento Z izquierdo/derecho grabado anteriormente en el submenú Canal . Seleccione el zoom más pequeño (0,36) y ajústelo para obtener la máxima claridad.
   3. Encuentre el límite X\Y y el rango Z de todo el órgano. Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición (preferiblemente menos de 10 ms) y haga clic en Ejecutar para comenzar.
   4. Si el tejido es demasiado grande, combine dos o más imágenes con la unión de imágenes. Abra el archivo capturado con el software de microscopía (en este caso, ZEISS ZEN 3.7). Seleccione Método de procesamiento > > Parámetro de método de unión > > Aplicar para completar la unión de imágenes.

4. Tratamiento y cuantificación de los datos

NOTA: Procese las pilas de imágenes con el software Imaris (análisis de imágenes), utilizando la función Superficie para etiquetar los glomérulos y realizar el análisis.

1. Recuento de glomérulos
   1. Importe imágenes grandes (microscopía confocal) o imágenes cosidas (microscopía de lámina de luz) en el software de análisis de imágenes.
   2. Abra los archivos en el software de análisis de imágenes. Haga clic en el botón Surface para crear una nueva Surface. Siga la guía en la parte inferior izquierda de la pantalla.
      1. Haga clic en el botón Siguiente (botón de flecha derecha) sin marcar nada.
      2. Marque la casilla antes de la opción Suavizar e introduzca un número adecuado (por ejemplo, 14,5) para controlar el detalle de la superficie. Seleccione Resta de fondo en Umbral y rellene el cuadro con el diámetro medio aproximado de los glomérulos. Haga clic en el botón Siguiente .
      3. Ajústelo si es necesario y haga clic en el botón Siguiente . Seleccione el rango adecuado y haga clic en el botón Siguiente para crear una Surface.
   3. Haga clic en Filtrar y, a continuación, en el botón Agregar para agregar esfericidad y filtrar los objetos no esféricos. Haga clic en el botón Duplicar para copiar esta nueva superficie.
   4. Haga clic en el botón Estadísticas y, a continuación, haga clic en el botón General ; el software presentará el número de glomérulos como el número total de superficies.
2. Volumen de los glomérulos
   1. Crea una superficie de los glomérulos como la anterior.
   2. Cuando se complete la superficie, haga clic en el botón Selección para seleccionar los objetos de destino y presentar el volumen de cada objeto. Haga clic en el botón Guardar y exporte las estadísticas a una hoja de cálculo para su posterior análisis.
3. Volumen de la rebanada o del riñón entero
   1. Importe imágenes grandes (microscopía confocal) o imágenes cosidas (microscopía de lámina de luz) en el software de análisis de imágenes.
   2. Abra archivos en el software de análisis de imágenes. Haga clic en el botón Surface para crear una nueva Surface. Siga la guía en la parte inferior izquierda de la pantalla.
      1. Haga clic en el botón Siguiente (botón de flecha derecha) sin marcar.
      2. Marque la casilla antes de la opción Suavizar e introduzca un número adecuado (por ejemplo, 50) para controlar los detalles de la superficie. Seleccione Intensidad absoluta en Umbral. Haga clic en el botón Siguiente .
      3. Ajuste la superficie hasta que cubra todo el tejido y haga clic en el botón Siguiente . Haga clic en el botón Siguiente para crear la superficie.
   3. Haga clic en el botón Selección para seleccionar la superficie de todo el tejido y presentar el volumen del tejido. Haga clic en el botón Guardar para exportar estadísticas a una hoja de cálculo.

Resultados

Este estudio proporciona un método simple y eficiente para etiquetar y analizar los glomérulos en riñones de ratones.

Los glomérulos (vasos sanguíneos) pueden ser bien marcados por FITC-Dextrano inyectado intravascularmente. Después del proceso de limpieza, el riñón se volvió transparente (Figura 1A) y los glomérulos se pudieron observar claramente mediante el uso de microscopía de lámina de luz (Figura 1B) o microscopía ...

Discusión

Las tecnologías de limpieza de tejidos se pueden clasificar en 3 o 4 grupos 29,30,31. En la limpieza de los riñones se ha aplicado la limpieza de tejidos a base de disolventes orgánicos (p. ej., DISCO y PEGASOS), la limpieza de tejidos a base de agua (p. ej., CUBIC) y la limpieza de tejidos con incrustación de hidrogel (p. ej., CLARITY) 25,26,28,32.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent