Un método eficiente y rápido para etiquetar y analizar glomérulos de ratón

Resumen

Este estudio presenta un conjunto de métodos fáciles de usar, completos y simples para etiquetar y analizar glomérulos de riñones de ratón aclarados por CUBIC. Los datos como el número y el volumen del glomérulo se pueden obtener de forma fácil y fiable utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextrano, microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) o microscopía confocal común y software como Imaris.

Resumen

Los glomérulos son unidades fundamentales en el riñón; Por lo tanto, el estudio de los glomérulos es fundamental para comprender la función renal y la patología. Las imágenes biológicas proporcionan información intuitiva; Por lo tanto, es de gran importancia etiquetar y observar los glomérulos. Sin embargo, los métodos de observación de glomérulos que se utilizan actualmente requieren operaciones complicadas y los resultados pueden perder detalles de la etiqueta o información tridimensional (3D). La tecnología de limpieza de tejidos de análisis computacional (CUBIC) y cócteles de imágenes cerebrales transparentes y sin obstrucciones se ha utilizado ampliamente en la investigación renal, lo que permite una detección más precisa y una profundidad de detección más profunda. Descubrimos que los glomérulos de ratón pueden marcarse rápida y eficazmente mediante la inyección en la vena de la cola de FITC-Dextrano de peso molecular medio, seguida del método de aclaramiento CUBIC. El riñón de ratón aclarado podría escanearse con un microscopio de lámina de luz (o un microscopio confocal cuando se corta) para obtener pilas de imágenes tridimensionales de todos los glomérulos de todo el riñón. Procesadas con el software adecuado, las señales de los glomérulos podrían digitalizarse fácilmente y analizarse más a fondo para medir el número, el volumen y la frecuencia de los glomérulos.

Introducción

El número y el volumen de los glomérulos son muy importantes para el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades renales 1,2,3,4,5. El estándar de oro de la estimación del número de glomérulos es la combinación física de disector/fraccionador. Sin embargo, este método requiere reactivos y equipos especiales, lo que lo hace lento y costoso 6,7,8,9. La biopsia proporciona una....

Protocolo

En este estudio se utilizaron ratones adultos C57BL/6 (6 semanas de edad, 25-30 g). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales de bienestar animal y ética experimental. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Biomédica del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan.

1. Marcaje de glomérulos y preparación de tejidos

1. Etiquetado de glomérulos
   1. Disolver FITC-dextrano (10 mg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x en una proporción de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar la solución de sonda de trabajo.
      NOTA: La solución de trabajo....

Resultados

Este estudio proporciona un método simple y eficiente para etiquetar y analizar los glomérulos en riñones de ratones.

Los glomérulos (vasos sanguíneos) pueden ser bien marcados por FITC-Dextrano inyectado intravascularmente. Después del proceso de limpieza, el riñón se volvió transparente (Figura 1A) y los glomérulos se pudieron observar claramente mediante el uso de microscopía de lámina de luz (Figura 1B) o microscopía .......

Discusión

Las tecnologías de limpieza de tejidos se pueden clasificar en 3 o 4 grupos 29,30,31. En la limpieza de los riñones se ha aplicado la limpieza de tejidos a base de disolventes orgánicos (p. ej., DISCO y PEGASOS), la limpieza de tejidos a base de agua (p. ej., CUBIC) y la limpieza de tejidos con incrustación de hidrogel (p. ej., CLARITY) 25,26,28,32.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent