שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

Summary

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

Abstract

הגלומרולי הן יחידות בסיסיות בכליה; לפיכך, לימוד הגלומרולי הוא חיוני להבנת תפקוד הכליות והפתולוגיה. הדמיה ביולוגית מספקת מידע אינטואיטיבי; לכן, יש משמעות רבה לתייג ולהתבונן גלומרולי. עם זאת, שיטות התצפית הגלומרוליות הנמצאות בשימוש כיום דורשות פעולות מסובכות, והתוצאות עלולות לאבד פרטי תווית או מידע תלת מימדי (תלת ממדי). הקוקטיילים הצלולים והבלתי מופרעים של דימות מוחי וניתוח חישובי (CUBIC) של טכנולוגיית ניקוי רקמות נמצאים בשימוש נרחב במחקר הכליות, ומאפשרים זיהוי מדויק יותר ועומק גילוי עמוק יותר. מצאנו כי גלומרולי עכבר יכול להיות מסומן במהירות וביעילות על ידי הזרקת ורידים זנב של משקל מולקולרי בינוני FITC-Dextran ואחריו שיטת ניקוי CUBIC. ניתן לסרוק את כליה העכבר המנוקה על ידי מיקרוסקופ אור (או מיקרוסקופ קונפוקלי כאשר פורסים) כדי לקבל ערימות תמונה תלת ממדיות של כל הגלומרולי בכליה כולה. מעובד עם תוכנה מתאימה, אותות glomeruli יכול להיות דיגיטלי בקלות ולנתח עוד יותר כדי למדוד את מספר, נפח, ותדירות של glomeruli.

Introduction

מספר ונפח glomeruli חשובים מאוד לאבחון וטיפול במחלות כליות שונות 1,2,3,4,5. תקן הזהב של הערכת מספר גלומרולי הוא שילוב הדיסקטור הפיזי / שבר. עם זאת, שיטה זו דורשת ריאגנטים מיוחדים וציוד, מה שהופך אותו איטי ויקר 6,7,8,9. ביופסיה מספקת שפע של מידע, אך ברור ששיטה זו מתאימה רק להערכות גסות^10,11. טכנולוגיות הדמיה רפואית, כולל ד....

Protocol

במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 בוגרים (בני 6 שבועות, 25-30 גרם). כל ההליכים בוצעו בהתאם לתקנות המקומיות של רווחת בעלי חיים ואתיקה ניסויית. המחקר אושר על ידי בית החולים מערב סין של ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי באוניברסיטת סצ'ואן.

1. תיוג גלומרולי והכנת רקמות

1. תיוג גלומרולי
   1. יש להמיס את FITC-דקסטרן (10 מ"ג) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ביחס של 1:1 (1 מ"ג: 1 מ"ל) להכנת תמיסת הבדיקה העובדת.
      הערה: ניתן לאחסן את פתרון העבודה ב- 4 °C למשך חודש אחד.
   2. הנח את העכבר C57 בקיבוע ורידים זנב עכבר. להרטיב את הגזה עם מים חמים, לעטוף את הגזה סביב החלק האמצעי של זנב העכבר, ולחמם את הזנב במשך 1 דקות.
   3. נגב ....

תוצאות

מחקר זה מספק שיטה פשוטה ויעילה לתיוג וניתוח הגלומרולי בכליות עכברים.

Glomeruli (כלי דם) יכול להיות מסומן היטב על ידי הזרקת כלי דם FITC-Dextran. לאחר תהליך הניקוי הכליה נעשתה שקופה (איור 1A), וניתן היה לראות בבירור את הגלומרולי באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור (איו.......

Discussion

טכנולוגיות ניקוי רקמות ניתן לסווג 3 או 4 קבוצות 29,30,31. ניקוי רקמות אורגני מבוסס ממס (למשל, DISCO ופגסוס), ניקוי רקמות על בסיס מימי (למשל, CUBIC), וניקוי רקמות הטבעה הידרוג'ל (למשל, CLARITY) יושמו כולם בניקוי כליות 25,26,28,32.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent