마우스 사구체를 표지하고 분석하기 위한 효율적이고 빠른 방법

요약

이 연구는 CUBIC이 제거된 마우스 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 사용하기 쉽고 완전하며 간단한 방법 세트를 제시합니다. 사구체 수 및 부피와 같은 데이터는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란, 광시트 형광 현미경(LSFM) 또는 일반적인 컨포칼 현미경 및 Imaris와 같은 소프트웨어를 사용하여 쉽고 안정적으로 얻을 수 있습니다.

초록

사구체는 신장의 기본 단위입니다. 따라서 사구체를 연구하는 것은 신장 기능과 병리를 이해하는 데 중추적인 역할을 합니다. 생물학적 이미징은 직관적인 정보를 제공합니다. 따라서 사구체에 라벨을 붙이고 관찰하는 것은 매우 중요합니다. 그러나 현재 사용되고 있는 사구체 관찰 방법은 복잡한 조작이 필요하며, 그 결과 라벨 디테일이나 3차원(3D) 정보가 손실될 수 있습니다. 명확하고 방해받지 않는 뇌 영상 칵테일 및 컴퓨터 분석(CUBIC) 조직 투명화 기술은 신장 연구에서 널리 사용되어 보다 정확한 검출과 더 깊은 검출 깊이를 제공합니다. 우리는 중분자량 FITC-Dextran의 꼬리 정맥 주입 후 CUBIC clearing 방법으로 마우스 사구체를 빠르고 효과적으로 표지할 수 있음을 발견했습니다. 제거된 쥐의 신장은 광시트 현미경(또는 얇게 썬 경우 컨포칼 현미경)으로 스캔하여 전체 신장에 있는 모든 사구체의 3차원 이미지 스택을 얻을 수 있습니다. 적절한 소프트웨어로 처리하면 사구체 신호를 쉽게 디지털화하고 추가로 분석하여 사구체의 수, 부피 및 주파수를 측정할 수 있습니다.

서문

사구체의 수와 양은 다양한 신장 질환의 진단과 치료에 매우 중요하다 ^1,2,3,4,5. 사구체 수 추정의 황금 표준은 물리적 해부기/분획기 조합입니다. 그러나 이 방법은 특수 시약과 장비가 필요하므로 느리고 비용이 많이 듭니다 ^6,7,8,9. 생검은 풍부한 정보를 제공하지만, 분명히, 이 방법은 대략적인 추정치에만 적합하다^10,11. 자기공명영상(MRI), 컴퓨터단층촬영(CT) 및 X-ray를 포함한 의료 영상 기술도 사구체 검출에 널리 사용되지만(12,13,14,15) 이러한 기술에는 부피가 큰 기구가 필요하다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 이미징 질량 분석기(¹⁶) 또는 두껍고 얇은 단면 방법⁽¹⁷)과 같은 새로운 방법도 사구체 검출에 사용되어 왔지만, 여전히 지루하고 힘들다.

투명성 기술의 도움으로 더 깊은 깊이를 관찰하고 두꺼운 조직 또는 전체 장기로부터 더 풍부하고 완전한 정보를 얻을 수 있습니다 18,19,20,21,22,23. 따라서 투명성 기술은 신장 연구에서 널리 사용되어 왔다²⁴. 깨끗해진 신장에서 사구체를 관찰하고 검출하는 것도 포함됩니다. 그러나, 이들 발표된 논문들은 사구체 검출(glomerular detection)²⁵을 간략하게만 언급했거나, 사구체를 표지하기 위해 형질전환 동물^{(transgenic animals)26}, 자체 생산된 염료^{(self-produced} dye)13 또는 고농도 항체 배양(high-concentration antibody incubation⁾²⁷과 같은 달성하기 어려운 표지 방법을 사용하였다. 또한, 여러 연구에서 투명신장의 사구체를 분석했지만, 분석은 항상 제한적이거나¹³ 저자가 직접 수립한 분석 알고리즘에 의존했다²⁶.

우리는 이전에 생쥐 신장에서 사구체를 표지하는 보다 편리한 방법을 시연한 바 있다²⁸. Imaris를 사용하여 사구체 수, 빈도 및 부피를 빠르게 얻을 수 있음을 발견했습니다. 따라서, 여기서는 생쥐 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 보다 접근하기 쉽고 포괄적이며 단순화된 일련의 방법을 제시합니다.

프로토콜

이 연구에서는 성체 C57BL/6마리 마우스(생후 6주, 25-30g)를 사용했습니다. 모든 절차는 동물 복지 및 실험 윤리에 대한 현지 규정을 준수하여 수행되었습니다. 이 연구는 쓰촨 대학 생물 의학 연구 윤리 위원회의 중국 서부 병원의 승인을 받았습니다.

1. 사구체 표지 및 조직 준비

1. 사구체 라벨링
   1. FITC-덱스트란(10mg)을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 1:1(1mg: 1mL)의 비율로 녹여 작업 프로브 용액을 준비합니다.
      알림: 작업 용액은 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
   2. C57 마우스를 마우스 꼬리 정맥 고정 장치에 놓습니다. 거즈를 뜨거운 물로 적시고 거즈를 쥐꼬리 중간 부분에 감싼 후 꼬리를 1분 동안 따뜻하게 합니다.
   3. 왼쪽 및 오른쪽 꼬리 정맥이 보일 때까지 75% 에탄올로 마우스 꼬리를 닦습니다.
   4. 1mL 인슐린 주사기로 작업 프로브 용액 100μL를 뽑고 용액을 마우스 꼬리 정맥에 천천히 주입합니다.
   5. 주입 후 프로브 용액을 30분 동안 순환시킵니다. 쥐가 새장에서 자유롭게 움직일 수 있도록 하십시오.
   6. 충분한 순환이 이루어지면 펜토바르비탈나트륨(1%, 60-80μg/kg)의 복강내 주사로 마우스를 깊이 마취합니다.
2. 신장 샘플링 및 고정
   1. 마취된 쥐를 앙와위 자세의 해부판에 고정합니다. 의료용 테이프로 발을 고정하십시오.
   2. 피부 준비 후 치사량의 펜토바르비탈 나트륨(1%, 10mg/kg)으로 쥐를 안락사시킵니다.
   3. 복강을 노출시키기 위해 정중선 복부 절개를 합니다.
   4. 신장을 드러내고 흄 후드에서 메스와 가위로 신장을 제거합니다. 신장 외피를 조심스럽게 제거합니다.
   5. 신장을 채취하여 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정합니다.
   6. PBS로 샘플을 실온(RT)에서 각각 1시간 동안 세 번 세척합니다.
   7. 현미경 검사를 위해 신장을 준비합니다.
      1. 컨포칼 현미경 검사를 위해 신장 절단: 절편 두께를 표준화하기 위해 뇌 매트릭스(1mm 강철, 40-75g)를 사용하여 신장을 1mm 두께로 자릅니다. 슬라이스를 4% PFA로 옮기고 4°C에서 밤새 고정을 계속합니다.
      2. 광시트 현미경 검사를 위한 전체 신장: 48시간 동안 4°C에서 4% PFA로 신장을 고정합니다.

2. 청산

1. 시약 준비
   1. 10 % (wt / wt) N- 부틸 디에탄올 아민, 10 % (wt / wt) Triton X-100 및 80 % ddH₂O를 혼합하여 CUBIC-L 시약을 준비합니다.
   2. 45%(wt/wt)의 안티피린, 30%(wt/wt)의 니코틴아미드, 0.5%(vol/vol)의 N-부틸디에탄올아민 및 24.5%의_ddH를혼합하여 CUBIC-R 시약을 제조합니다.
      참고: CUBIC-L은 탈지질화에 사용되며 CUBIC-R은 굴절률 매칭에 사용됩니다.
2. 청산 절차
   1. 50mL 원심분리 튜브에서 신장 샘플을 채취한 다음 37°C에서 60rpm으로 진탕하여 CUBIC-L에서 투명화합니다. 만족스러운 광학적 투명성을 얻을 때까지 4시간마다(신장 절편의 경우) 또는 24시간마다(신장 전체의 경우) CUBIC-L을 교체하십시오.
      참고: 이 과정은 신장 절편의 경우 1일, 전체 신장의 경우 5일이 소요됩니다.
   2. 샘플을 PBS에서 각각 1시간 동안 RT에서 부드럽게 흔들어 세 번 세척합니다.
   3. CUBIC-R을 샘플에 바르고 37°C, 60rpm에서 6시간 동안 샘플을 흔듭니다.
   4. 투명화된 샘플을 직접 관찰하거나 CUBIC-R로 채워진 검은색 튜브에 1주일 동안 RT로 보관합니다.

3. 이미지 취득

1. 컨포칼 이미징
   참고: 컨포칼 현미경(렌즈: Plan Apo λ 4×/0.2 N1 대물렌즈 또는 Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1 대물렌즈)으로 얇게 썬 신장 샘플을 이미지화합니다. z-stack을 사용하여 큰 이미지(예: 신장 절편의 경우 6052 μm x 6052 μm)를 캡처할 수 있습니다.
   1. 컨포칼 현미경을 레이저 출력, 컨포칼 제어 스위치, 컴퓨터, 현미경 및 컨포칼 하드웨어의 순서로 켭니다. 자체 테스트를 실행한 후 공초점 소프트웨어를 켭니다.
   2. 적절한 렌즈를 선택합니다. CUBIC-R 시약에서 샘플을 꺼내 컨포칼 접시에 넣고 뚜껑을 덮어 CUBIC-R 시약이 마르지 않도록 합니다.
   3. 샘플을 시야 중앙으로 이동하고 초점이 맞춰질 때까지 초점면을 조정합니다.
   4. 3D 재구성(3.1.4.1단계) 및 큰 이미지 재구성(3.1.4.2-3.1.4.3단계)을 적용합니다.
      1. 3D 재구성(공초점): 형광이 보이지 않을 때까지 확대/축소 평면을 한 방향으로 전환합니다. 이 위치는 맨 위로 정의됩니다. 그런 다음 형광이 보이지 않을 때까지 확대/축소 평면을 반대 방향으로 전환합니다. 이 위치는 맨 아래로 정의됩니다. 대화 상자의 오른쪽 하단 모서리에 있는 실행 버튼을 클릭하여 스캔을 시작합니다.
      2. 큰 이미지 재구성(공초점): 시야를 샘플의 중앙으로 이동하고 현재 위치를 중심으로 설정합니다. 2 x 2 시야각을 선택합니다.
      3. ND 다기능 인터페이스에서 Z 스택 을 선택하여 큰 이미지를 재구성하고 패널에서 다양한 옵션을 설정합니다. 그런 다음 Run butto n을 눌러 스캔을 시작합니다.
2. 광시트 형광 현미경(LSFM) 이미징
   참고: 광시트 형광 현미경(렌즈: EC Plan-Neofluar 5x/0.16(Medium n = 1.529) 대물렌즈)로 전체 신장을 이미지화합니다.
   1. 샘플 부착(LSFM):
      1. 투명한 신장을 검체 고정 어댑터에 붙이고 신장이 단단히 부착될 때까지 기다립니다.
      2. 신장을 샘플 용기에 담그고 샘플 용기를 현미경 시스템에 밀어 넣습니다. 해치를 닫습니다.
   2. 관찰 및 스캔(LSFM):
      1. 위치 찾기 인터페이스에서 샘플을 적절한 관찰 위치로 이동합니다. 획득 인터페이스로 전환하고, 광학 경로를 설정하고, 488nm 레이저, LBF 405/488/561/640, 광학 분할 필터 블록 SBS LP 490을 선택하고, 카메라 2를 선택하고, 의사 색상을 녹색으로 변경합니다.
      2. 이전에 채널 하위 메뉴에서 기록한 왼쪽/오른쪽 Z 오프셋 값을 채웁니다. 가장 작은 확대/축소(0.36)를 선택하고 최대 선명도를 위해 미세 조정합니다.
   3. 전체 오르간의 X\Y 경계와 Z 범위를 찾습니다. 레이저 강도와 노출 시간(10ms 미만 선호)을 조정하고 Run(실행 )을 클릭하여 시작합니다.
   4. 조직이 너무 크면 이미지 스티칭을 사용하여 두 개 이상의 이미지를 병합합니다. 현미경 소프트웨어(여기서는 ZEISS ZEN 3.7)를 사용하여 캡처한 파일을 엽니다. Processing > Method > Stitching > Method Parameter > Apply 를 선택하여 이미지 스티칭을 완료합니다.

4. 데이터 처리 및 정량화

알림: Imaris (이미지 분석) 소프트웨어로 이미지 스택을 처리하고 Surface 기능을 사용하여 사구체에 레이블을 지정하고 분석을 수행합니다.

1. 사구체 수
   1. 큰 이미지(컨포칼 현미경 검사) 또는 스티칭된 이미지(광시트 현미경 검사)를 이미지 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.
   2. 이미지 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 서피스 버튼을 클릭하여 새 서피스를 생성합니다. 화면 왼쪽 하단의 안내를 따릅니다.
      1. 아무 것도 선택하지 않고 다음 버튼(오른쪽 화살표 버튼)을 클릭합니다.
      2. 스무딩(Smooth) 옵션 앞의 박스를 선택하고 적절한 숫자(예: 14.5)를 입력하여 표면의 디테일을 제어합니다. 임계값 설정(Thresholding)에서 배경 빼기(Background Subtraction)를 선택하고 사구체의 대략적인 평균 직경으로 상자를 채웁니다. 다음 버튼을 클릭합니다.
      3. 필요한 경우 조정하고 다음 버튼을 클릭합니다. 적절한 범위를 선택하고 다음 버튼을 클릭하여 표면을 만듭니다.
   3. Filter(필터)를 클릭한 다음 Add(추가) 버튼을 클릭하여 Sphericity(구형)를 추가하여 구형이 아닌 개체를 필터링합니다. 복제(Duplicate) 버튼을 클릭하여 이 새 서피스를 복사합니다.
   4. Statistics 버튼을 클릭한 다음 Overall 버튼을 클릭합니다. 소프트웨어는 사구체의 수를 Total Number of Surface로 표시합니다.
2. 사구체의 부피
   1. 위와 같이 사구체의 표면을 만듭니다.
   2. 표면이 완성되면 선택 버튼을 클릭하여 대상 객체를 선택하고 모든 객체의 체적을 표시합니다. 저장 버튼을 클릭하고 추가 분석을 위해 통계를 스프레드시트로 내보냅니다.
3. 신장 조각 또는 전체 콩팥의 부피
   1. 큰 이미지(컨포칼 현미경 검사) 또는 스티칭된 이미지(광시트 현미경 검사)를 이미지 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.
   2. 이미지 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. 서피스 버튼을 클릭하여 새 서피스를 생성합니다. 화면 왼쪽 하단의 안내를 따릅니다.
      1. 체크하지 않고 다음 버튼(오른쪽 화살표 버튼)을 클릭합니다.
      2. 스무딩(Smooth) 옵션 앞의 박스를 선택하고 적절한 숫자(예: 50)를 입력하여 표면의 디테일을 제어합니다. 임계값 설정(Thresholding)에서 절대 강도(Absolute Intensity)를 선택합니다. 다음 버튼을 클릭합니다.
      3. 전체 조직을 덮을 때까지 Surface를 조정하고 다음 버튼을 클릭합니다. 다음( Next ) 버튼을 클릭하여 서피스를 생성합니다.
   3. 선택(Selection) 버튼을 클릭하여 전체 조직의 표면(Surface)을 선택하고 조직의 부피를 표시합니다. 저장 버튼을 클릭하여 통계를 스프레드시트로 내보냅니다.

결과

이 연구는 생쥐 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다.

사구체(혈관)는 혈관 내 주입된 FITC-덱스트란에 의해 잘 표지될 수 있습니다. 투명화 과정 후 신장은 투명해졌고(그림 1A), 광시트 현미경(그림 1B) 또는 공초점 현미경(그림 1C)을 사용하여 사구체를 명확하게 관찰...

토론

조직 투명화 기술은 3개 또는 4개 그룹으로 분류할 수^있다 29,30,31. 유기 용매 기반 조직 투명화(예: DISCO 및 PEGASOS), 수성 기반 조직 투명화(예: CUBIC) 및 하이드로겔 포매 조직 투명화(예: CLARITY)는 모두 신장 투명화에 적용되었습니다(25,26,28,32).

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent