Um método eficiente e rápido para rotular e analisar glomérulos de camundongos

Resumo

Este estudo apresenta um conjunto fácil de usar, completo e simples de métodos para marcar e analisar glomérulos de rins de camundongos eliminados pela CUBIC. Dados como número e volume de glomérulos podem ser obtidos de forma fácil e confiável usando isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Dextran, microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM) ou microscopia confocal comum e software como Imaris.

Resumo

Os glomérulos são unidades fundamentais no rim; portanto, o estudo dos glomérulos é fundamental para a compreensão da função renal e da patologia. As imagens biológicas fornecem informações intuitivas; Assim, é de grande importância rotular e observar os glomérulos. No entanto, os métodos de observação de glomérulos atualmente em uso requerem operações complicadas, e os resultados podem perder detalhes do rótulo ou informações tridimensionais (3D). A tecnologia de limpeza de tecido de análise computacional (CUBIC) tem sido amplamente utilizada em pesquisas renais, permitindo uma detecção mais precisa e profundidade de detecção mais profunda. Descobrimos que os glomérulos de camundongos podem ser marcados rápida e efetivamente por injeção na veia caudal de FITC-Dextran de peso molecular médio seguida pelo método de limpeza cúbica. O rim de camundongo limpo poderia ser escaneado por um microscópio de folha de luz (ou um microscópio confocal quando fatiado) para obter pilhas de imagens tridimensionais de todos os glomérulos em todo o rim. Processados com software apropriado, os sinais dos glomérulos poderiam ser facilmente digitalizados e posteriormente analisados para medir o número, volume e frequência dos glomérulos.

Introdução

O número e o volume dos glomérulos são muito importantes para o diagnóstico e tratamento de diversas doenças renais1,2,3,4,5. O padrão-ouro da estimativa do número de glomérulos é a combinação dissector físico/fracionador. Entretanto, esse método requer reagentes e equipamentos especiais, tornando-o lento e dispendioso 6,7,8,9. A biópsia fornece uma riqueza de informações, mas obviamente esse método só é adequado para estimativas aproximadas^10,11. Tecnologias de imagem médica, incluindo ressonância magnética (RM), tomografia computadorizada (TC) e raios-X, também são amplamente utilizadas na detecção glomerular12,13,14,15, mas requerem instrumentos volumosos. Novos métodos, como o espectrômetro de massa de imagem por dessorção/ionização a laser assistido por matriz (MALDI)¹⁶ ou o método de cortes grossos e finos¹⁷, também têm sido usados na detecção glomerular, embora permaneçam tediosos e trabalhosos.

Com o auxílio das tecnologias de transparência, é possível observar profundidades mais profundas e obter informações mais ricas e completas de tecidos espessos ou mesmo de órgãos inteiros 18,19,20,21,22,23. Portanto, as tecnologias de transparência têm sido amplamente utilizadas na pesquisa renal²⁴. A observação e detecção de glomérulos nos rins limpos também estão envolvidas. No entanto, esses artigos publicados ou se referiam apenas brevemente à detecção glomerular²⁵ ou utilizavam métodos de marcação de difícil obtenção como animais transgênicos²⁶, corantes autoproduzidos¹³ ou incubação de anticorpos em alta concentração²⁷ para marcar os glomérulos. Além disso, apesar de estudos terem analisado glomérulos em rins liberados, as análises foram sempre limitadas¹³ ou baseadas em algoritmos de análise estabelecidos pelos próprios autores²⁶.

Demonstramos anteriormente uma maneira mais conveniente de marcar os glomérulos em rins de camundongos²⁸. Com o uso do Imaris, verificou-se que a contagem, a frequência e o volume dos glomérulos puderam ser obtidos rapidamente. Assim, apresentamos aqui um conjunto mais acessível, abrangente e simplificado de métodos para rotular e analisar os glomérulos de rins de camundongos.

Protocolo

Camundongos adultos C57BL/6 (6 semanas de idade, 25-30 g) foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas locais de bem-estar animal e ética experimental. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan.

1. Marcação de glomérulos e preparação de tecidos

1. Rotulagem de glomérulos
   1. Dissolver FITC-dextran (10 mg) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) na proporção de 1:1 (1 mg: 1 mL) para preparar a solução de sonda de trabalho.
      NOTA: A solução de trabalho pode ser armazenada a 4 °C durante 1 mês.
   2. Coloque o rato C57 num fixador da veia da cauda do rato. Molhe a gaze com água quente, envolva a gaze em torno da parte média da cauda do rato e aqueça a cauda por 1 min.
   3. Limpe a cauda do rato com etanol a 75% até que as veias da cauda esquerda e direita estejam visíveis.
   4. Retirar 100 μL da solução da sonda de trabalho com uma seringa de insulina de 1 ml e injetar lentamente a solução na veia da cauda do rato.
   5. Após a injeção, deixe a solução da sonda circular por 30 min. Permita que os ratos se movam livremente em suas gaiolas.
   6. Uma vez alcançada circulação suficiente, anestesiar profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (1%, 60-80 μg/kg).
2. Amostragem e fixação do rim
   1. Fixar os camundongos anestesiados na placa anatômica em decúbito dorsal. Segure as patas com fita adesiva.
   2. Após o preparo da pele, eutanasiar os camundongos com uma dose letal de pentobarbital sódico (1%, 10 mg/kg).
   3. Faça uma incisão abdominal mediana para expor a cavidade abdominal.
   4. Revele os rins e remova-os com bisturi e tesoura no exaustor. Retire o envelope renal suavemente.
   5. Recolher os rins e fixá-los em paraformaldeído (PFA) a 4 % a 4 °C durante a noite.
   6. Lavar as amostras com PBS três vezes 1 h cada com agitação à temperatura ambiente (TR).
   7. Prepare o rim para microscopia.
      1. Corte o rim para microscopia confocal: Corte o rim em cortes de 1 mm de espessura usando a matriz cerebral (aço de 1 mm, 40-75 g) para padronizar a espessura do corte. Transfira as fatias para PFA a 4% e continue a fixação a 4 °C durante a noite.
      2. Rim total para microscopia de folha óptica: Fixar os rins em PFA a 4% a 4 °C durante 48 horas.

2. Compensação

1. Preparação de reagentes
   1. Preparar o reagente CUBIC-L misturando 10% (m/m) de N-butildietanolamina, 10% (m/m) Triton X-100 e 80% ddH₂O.
   2. Preparar o reagente CUBIC-R misturando 45% (m/m) de antipirina, 30% (m/m) de nicotinamida, 0,5% (vol/vol) de N-butildietanolamina e 24,5% ddH₂O. Certifique-se de que a solução tenha um pH de 9,6-9,8 e um índice de refração (IR) de 1,522.
      NOTA: CUBIC-L é usado para deslipidação, e CUBIC-R é usado para correspondência de índice de refração.
2. Procedimento de compensação
   1. Recolher as amostras de rim num tubo de centrífuga de 50 ml e, em seguida, limpá-las em CUBIC-L com agitação a 60 rpm a 37 °C. Substitua o CUBIC-L a cada 4 h (para fatias de rim) ou a cada 24 h (para um rim inteiro) até obter transparência óptica satisfatória.
      NOTA: Este processo leva 1 dia para fatias de rim e 5 dias para um rim inteiro.
   2. Lavar as amostras três vezes em PBS com agitação suave em RT por 1 h cada.
   3. Aplicar CUBIC-R às amostras, agitando as amostras a 37 °C, 60 rpm durante 6 h.
   4. Observe diretamente as amostras liberadas ou armazene-as em tubos pretos preenchidos com CUBIC-R no TR por 1 semana.

3. Aquisição de imagens

1. Imagem confocal
   NOTA: Imagem das amostras de rim fatiadas com microscopia confocal (Lentes: Uma objetiva Plan Apo λ 4×/0.2 N1 ou uma objetiva Plan Apo VC 10×/0.45 DIC N1). Capture imagens grandes (por exemplo, 6052 μm x 6052 μm para a fatia de rim) com z-stacks.
   1. Ligue o microscópio confocal na seguinte sequência: potência do laser, interruptor de controle confocal, computador, microscópio e hardware confocal. Depois de executar o autoteste, ligue o software confocal.
   2. Selecione a lente apropriada. Retire a amostra do reagente CUBIC-R, coloque-a na placa confocal e cubra-a para evitar que o reagente CUBIC-R seque.
   3. Mova a amostra para o meio do campo de visão e ajuste o plano focal até que esteja em foco.
   4. Aplicar reconstrução 3D (passo 3.1.4.1) e reconstrução de imagem grande (passos 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. Reconstrução 3D (confocal): Alterne o plano de zoom em uma direção até que nenhuma fluorescência seja visível; Esta posição é definida como a parte superior. Em seguida, alterne o plano de zoom na direção oposta até que nenhuma fluorescência seja visível; Esta posição é definida como a parte inferior. Clique no botão Executar no canto inferior direito da caixa de diálogo para iniciar a verificação.
      2. Reconstrução de imagem grande (confocal): mova o campo de visão para o meio da amostra e defina a posição atual como centro. Selecione um campo de visão 2 x 2.
      3. Na interface multifuncional ND, selecione a pilha Z para reconstruir imagens grandes e definir diferentes opções no painel. Em seguida, pressione o botão Executar para n para iniciar a varredura.
2. Imagem por microscopia de fluorescência de folha de luz (LSFM)
   OBS: Imagem de todos os rins com microscópio de fluorescência de folha de luz (Lente: EC Plan-Neofluar 5x/0,16 (Médio n = 1,529) objetiva).
   1. Fixação de amostra (LSFM):
      1. Cole o rim transparente ao adaptador de fixação da amostra e aguarde até que o rim esteja firmemente fixado.
      2. Mergulhe o rim no compartimento de amostra e empurre o compartimento de amostra para o sistema de microscópio. Feche a escotilha.
   2. Observar e digitalizar (LSFM):
      1. Na interface Localizar , mova a amostra para uma posição de observação adequada. Alterne para a interface de aquisição , defina o caminho óptico, selecione laser de 488 nm, LBF 405/488/561/640, bloco de filtro de divisão óptica SBS LP 490, selecione Câmera 2 e altere a pseudocor para verde.
      2. Preencha o valor de Deslocamento Z Esquerdo/Direito, registrado anteriormente no submenu Canal . Selecione o menor zoom (0,36) e ajuste-o para máxima clareza.
   3. Encontre o limite X\Y e o intervalo Z de todo o órgão. Ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição (de preferência inferior a 10 ms) e clique em Executar para iniciar.
   4. Se o tecido for muito grande, mescle duas ou mais imagens com costura de imagem. Abra o arquivo capturado usando o software de microscopia (aqui, ZEISS ZEN 3.7). Selecione Processando > Método > Costurando > Parâmetro de Método > Aplicar à costura de imagem completa.

4. Processamento e quantificação de dados

NOTA: Processe as pilhas de imagens com o software Imaris (análise de imagem), usando a função Surface para rotular os glomérulos e realizar a análise.

1. Conde de glomérulos
   1. Importe imagens grandes (microscopia confocal) ou imagens costuradas (microscopia de folha) para o software de análise de imagens.
   2. Abra os arquivos no software de análise de imagem. Clique no botão Surface para criar um novo Surface. Siga o guia na parte inferior esquerda da tela.
      1. Clique no botão Avançar (botão de seta para a direita) sem marcar nada.
      2. Marque a caixa antes da opção Liso e insira um número adequado (por exemplo, 14.5) para controlar os detalhes do Surface. Selecione Subtração em segundo plano em Limiar e preencha a caixa com o diâmetro médio aproximado dos glomérulos. Clique no botão Avançar .
      3. Ajuste se necessário e clique no botão Avançar . Selecione o intervalo adequado e clique no botão Seguinte para criar um Surface.
   3. Clique em Filtrar e, em seguida, no botão Adicionar para adicionar Esfericidade para filtrar objetos não esféricos. Clique no botão Duplicar para copiar esta nova superfície.
   4. Clique no botão Estatísticas e, em seguida, clique no botão Geral ; o software apresentará o número de glomérulos como o Número Total de Superfície.
2. Volume de glomérulos
   1. Crie uma superfície dos glomérulos como acima.
   2. Quando o Surface estiver concluído, clique no botão Seleção para selecionar os objetos de destino e apresentar o volume de cada objeto. Clique no botão Salvar e exporte estatísticas para uma planilha para análise adicional.
3. Volume da fatia ou rim inteiro
   1. Importe imagens grandes (microscopia confocal) ou imagens costuradas (microscopia de folha) para o software de análise de imagens.
   2. Abra arquivos no software de análise de imagens. Clique no botão Surface para criar um novo Surface. Siga o guia na parte inferior esquerda da tela.
      1. Clique no botão Avançar (botão de seta para a direita) sem marcar.
      2. Marque a caixa antes da opção Liso e insira um número adequado (por exemplo, 50) para controlar os detalhes do Surface. Selecione Intensidade absoluta em Limite. Clique no botão Avançar .
      3. Ajuste o Surface até cobrir todo o tecido e clique no botão Seguinte . Clique no botão Seguinte para criar o Surface.
   3. Clique no botão Seleção para selecionar a Superfície de todo o tecido e apresentar o volume do tecido. Clique no botão Salvar para exportar estatísticas para uma planilha.

Resultados

Este estudo fornece um método simples e eficiente para marcar e analisar os glomérulos em rins de camundongos.

Os glomérulos (vasos sanguíneos) podem ser bem marcados por FITC-Dextran injetado intravascularmente. Após o clareamento, o rim tornou-se transparente (Figura 1A), e os glomérulos puderam ser claramente observados por meio de microscopia óptica (Figura 1B) ou microscopia confocal (Figura 1C

Discussão

As tecnologias de desobstrução tecidual podem ser classificadas em 3 ou 4 grupos 29,30,31. A limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos (por exemplo, DISCO e PEGASOS), a limpeza de tecidos à base de água (por exemplo, CUBIC) e a limpeza de tecidos incorporados a hidrogel (por exemplo, CLARITY) foram aplicadas na limpeza renal 25,26,28,32.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% PFA	Biosharp	7007171800	Fixation reaagen
502 Glue	Deli	7146	For fixing the kidney to the sample fixing adapter
Antipyrine	Aladdin	A110660	Clearing reagent
Brain Matrix	RWD Life Science	1mm 40-75	Tissue slicing
Confocal microscopy	Nikon	A1plus	Image acquisition
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD150S	Labeling reagent
Light sheet fluorescence microscopy	Zeiss	Light sheet 7	Image acquisition
Mice	Ensiweier		Adult C57BL/6 mice (6 weeks of age, 25–30 g)
N-Butyldiethanolamine	Aladdin	B299095	Clearing reagent
Nicotinamide	Aladdin	N105042	Clearing reagent
Pentobarbital Natriumsalz	Sigma-Aldrich	P3761
Tail vein fixator	JINUOTAI	JNT-FS35	Fix the mouse for vail injection
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Clearing reagent