JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول تحليلات نوعية وكمية لإجمالي siderophores و pyoverdine و pyochelin من Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

تشتهر الزائفة الزنجارية (P. aeruginosa) بإنتاجها لمجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف. إحدى هذه الآليات هي كسح الحديد من خلال إنتاج siderophore. تنتج P. aeruginosa نوعين مختلفين: pyochelin ، الذي لديه تقارب مخلب أقل للحديد ، و pyoverdine ، الذي لديه تقارب مخلب أعلى للحديد. يوضح هذا التقرير أنه يمكن قياس البيوفيردين مباشرة من المواد الطافية البكتيرية ، بينما يحتاج البيوشلين إلى استخلاصه من المواد الطافية قبل القياس الكمي.

الطريقة الأساسية للتحليل النوعي لإنتاج siderophore هي مقايسة لوحة أجار كروم أزورول سلفونات (CAS). في هذا الفحص ، يؤدي إطلاق صبغة CAS من مركب Fe3+-Dye إلى تغيير اللون من الأزرق إلى البرتقالي ، مما يشير إلى إنتاج siderophore. من أجل القياس الكمي للسيدروفورات الكلية ، تم خلط المواد الطافية البكتيرية بنسب متساوية مع صبغة CAS في لوحة عيار ميكروي ، متبوعة بالتحليل الطيفي عند 630 نانومتر. تم قياس Pyoverdine مباشرة من المادة الطافية البكتيرية عن طريق مزجها بنسب متساوية مع 50 mM Tris-HCl ، متبوعا بالتحليل الطيفي. أكدت ذروة عند 380 نانومتر وجود البيوفيردين. أما بالنسبة ل Pyochelin ، فلم يكن القياس الكمي المباشر من الطافية البكتيرية ممكنا ، لذلك كان لا بد من استخراجه أولا. كشف التحليل الطيفي اللاحق عن وجود pyochelin ، مع ذروة عند 313 نانومتر.

Introduction

تحتاج الكائنات الحية إلى الحديد لأداء وظائف حيوية مختلفة ، مثل نقل الإلكترونات وتضاعف الحمض النووي1. من المعروف أن Pseudomonas aeruginosa ، وهو أحد مسببات الأمراض الانتهازية سالبة الجرام ، يمتلك مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف ، من بينها آلية واحدة هي تكوين siderophore2. خلال ظروف استنفاد الحديد ، تطلق P. aeruginosa جزيئات متخصصة تسمى siderophores ، والتي تروي الحديد من البيئة المحيطة. Siderophores يخلب الحديد خارج الخلية ، ويتم نقل مجمع ferric-siderophore الناتج بنشاط إلى الخلية3.

من المعروف أن P. aeruginosa تنتج اثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin. من المعروف أن البيوفيردين لديه تقارب مخلب أعلى للحديد (1: 1) ، بينما من المعروف أن البيوشلين له تقارب مخلب أقل للحديد (2: 1) 4. يطلق على Pyochelin أيضا اسم siderophore الثانوي لأنه يحتوي على تقارب مخلب أقل منالحديد 5. يتم التحكم في إنتاج وتنظيم siderophores بنشاط بواسطة أنظمة استشعار النصاب (QS) في P. aeruginosa6.

إلى جانب تبريد الحديد ، تشارك siderophores أيضا في تنظيم عوامل الفوعة وتلعب دورا نشطا في تكوين الأغشية الحيوية7. تخدم Siderophores أدوارا حاسمة إضافية ، بما في ذلك المشاركة في إشارات الخلية ، والدفاع ضد الإجهاد التأكسدي ، وتسهيل التفاعلات بين المجتمعات الميكروبية8. عادة ما يتم تصنيف Siderophores بناء على المجموعات الوظيفية المحددة التي يخلبون من خلالها الحديد. الروابط الثلاثة الأولية في هذا التصنيف هي التصنيف ، والهيدروكسيمات ، و α-هيدروكسي كربوكسيلات3. Pyoverdines هي السمات المميزة لأنواع Pseudomonas الفلورية مثل P. aeruginosa و P. fluorescens5. وهي تتكون من كروموفور فلوري أخضر مختلط مقترن بقليل الببتيد يحتوي على 6-12 من الأحماض الأمينية. تشارك العديد من توليفات الببتيد غير الريبوسومية (NRPs) في تخليقها9. أربعة جينات تشارك في إنتاج وتنظيم البيوفيردين هي pvdL و pvdI و pvdJ و pvdD10. Pyoverdine مسؤول أيضا عن العدوى والفوعة في الثدييات11. يلاحظ أن P. aeruginosa تنتج البيوشلين في ظروف معتدلة تحد من الحديد ، بينما يتم إنتاج البيوفيردين خلال البيئات الشديدة التي تحد من الحديد12. اثنان من الأوبيرونات المشاركة في إنتاج pyochelin هما pchDCBA و pchEFGHI13. تجدر الإشارة إلى أنه في وجود البيوسيانين ، يؤدي البيوشلين (التصنيف) إلى تلف الأكسدة والالتهابات ويولد جذور الهيدروكسيل الضارة بالأنسجة المضيفة11.

تم اعتماد مقايسة كروم أزورول سلفونات (CAS) على نطاق واسع نظرا لشموليتها وحساسيتها العالية وملاءمتها الأكبر مقارنة بالمقايسات الميكروبيولوجية ، والتي ، على الرغم من حساسيتها ، يمكن أن تكون محددة بشكل مفرط14. يمكن إجراء اختبار CAS على أسطح أجار أو في محلول. يعتمد على تغير اللون الذي يحدث عندما ينتقل أيون الحديديك من مركبه الأزرق المكثف إلى اللون البرتقالي. يحدد الفحص اللوني CAS استنفاد الحديد من مركب ثلاثي الفاعل بالسطح Fe-CAS. هذا المركب الخاص ، الذي يتكون من المعدن والصبغة العضوية والسطحي ، له لون أزرق ويظهر ذروة امتصاص عند 630 نانومتر.

يقدم هذا التقرير طريقة للكشف النوعي عن إنتاج siderophore ، حيث يمكن للمرء اكتشاف إنتاج siderophores على لوحة أجار. كما يتم توفير طريقة للتقدير الكمي لإجمالي إنتاج siderophore في لوحة microtiter والكشف والتحليل الكمي لاثنين من siderophores ، pyoverdine و pyochelin ، من P. aeruginosa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحصول على جميع العزلات البكتيرية ل P. aeruginosa من مختبرات علم الأحياء الدقيقة الطبية من فادودارا وجايبور ، الهند. تم التعامل مع جميع العزلات السريرية المختارة في خزانة السلامة الحيوية (BSL2) وتم توخي أقصى درجات الحذر أثناء التعامل مع العزلات البكتيرية أثناء التجارب. يتم توفير التفاصيل التجارية لجميع الكواشف / الحلول في جدول المواد.

1. تحضير صبغة كروم أزورول سلفونات (CAS) ووسائط أجار

  1. تحضير صبغة CAS (100 مل) بالتركيب التالي:
    1. قم بإذابة 60 مجم من CAS في 50 مل من الماء المقطر (الحل 1).
    2. قم بإذابة 2.7 مجم من FeCl3 · 6H2O في 10 مل من 10 mM HCl (محلول 2).
    3. قم بإذابة 73 مجم من بروميد السيتريمونيوم (HDTMA) في 40 مل من الماء المقطر (محلول 3).
    4. امزج بعناية الحل 1 والحل 2 والحل 3. تخزينها في زجاجة.
  2. قم بإعداد CAS agar باتباع الخطوات التالية:
    1. أضف 100 مل من محلول الملح MM9 إلى 750 مل من الماء المقطر.
    2. قم بإذابة 32.24 جم من حمض بيبيرازين-N، N'-bis (2-إيثان سلفونيك حمض) (PIPES).
    3. أضف 15 جم من أجار أجار. الأوتوكلاف واتركه ليبرد.
    4. أضف 30 مل من محلول حمض الكازامينو المعقم و 10 مل من محلول الجلوكوز المعقم بنسبة 20٪ إلى الخليط.
    5. أضف 100 مل من صبغة CAS واخلطها واسكبها في ظروف معقمة.
      ملاحظة: يتم توفير تحضير وسائط MM9 ومحلول حمض الكازامينو و8-هيدروكسيكينولين في الملف التكميلي 1. المخزن المؤقت PIPES حساس لدرجة الحموضة. لن يذوب حتى يتم تحقيق الرقم الهيدروجيني 5.6. تأكد من مراقبة الرقم الهيدروجيني باستمرار لأنه عندما تبدأ الأنابيب في الذوبان في الماء ، فإنها ستزيد من خفض درجة الحموضة. استخراج حمض Casamino مع نفس الحجم من 3 ٪ 8-هيدروكسي كينولين المذاب في الكلوروفورم. اترك المحلول غير القابل للامتزاج عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا واجمع المرحلة العليا من المحلول بعناية دون الإخلال بالمرحلة السفلية.

2. التحليل النوعي لإنتاج siderophores

  1. اضبط OD600 نانومتر على 0.2 لمزارع P . aeruginosa المزروعة لمدة 24 ساعة.
  2. باستخدام حلقة سلكية معقمة ، قم بخط الثقافة البكتيرية على لوحة أجار CAS.
  3. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام وسائط مياه الببتون أو محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.8٪ لتخفيف الثقافة البكتيرية. إذا لم يلاحظ نمو البكتيريا في 24 ساعة ، احتضان لوحات CAS لمدة 48 إلى 72 ساعة.

3. التقدير الكمي لإجمالي siderophores

  1. إعادة تلقيح المستنبتات المزروعة لمدة 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط مياه Peptone بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 ، واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. بعد 48 ساعة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بزراعة البكتيريا عند 4650 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد الطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا إلى صفيحة عيار ميكرو 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من صبغة CAS إليها.
  4. غطي الطبق بورق الألمنيوم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  5. بعد الحضانة ، خذ قراءات طيفية عند 630 نانومتر.
  6. احسب النتائج التي تم الحصول عليها لتحديد كمية إجمالي siderophores كنسبة مئوية لوحدة siderophore (PSU).
    ملاحظة: يمكن حساب PSU على النحو التالي: [(Ar - As) / Ar] × 100
    حيث ، Ar = امتصاص المرجع عند 630 نانومتر ، As = امتصاص الطافي الخالي من الخلايا للعينة. كمرجع ، يجب إضافة صبغة CAS إلى وسائط مياه الببتون غير الملقحة. املأ جميع الأواني الزجاجية ، مثل أنابيب الاختبار والقوارير وما إلى ذلك ، ب 6 M HCl لمدة 2 ساعة واشطفها مرتين بالماء المقطر لإزالة أي أثر للحديد عليها.

4. التقدير الكمي للبيوفردين

  1. إعادة تلقيح المستنبتات المزروعة على مدار 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط مياه Peptone بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  2. بعد 48 ساعة ، قم بقياس OD600 نانومتر من نمو البكتيريا قبل المضي قدما.
  3. أجهزة الطرد المركزي الثقافة البكتيرية في 4650 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. بعد الطرد المركزي ، أضف 100 ميكرولتر من المادة الطافية الخالية من الخلايا إلى صفيحة عيار ميكرو ذات 96 بئرا وأضف 100 ميكرولتر من 50 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) إليها.
  5. خذ قراءات طيفية عند OD405 نانومتر.

5. استخراج Pyochelin وقياس الطيف الضوئي

  1. إعادة تلقيح المستزرعات المزروعة لمدة 24 ساعة من P. aeruginosa في وسط King's B (الملف التكميلي 1) بعد ضبط OD600 نانومتر إلى 0.25 واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. بعد 24 ساعة ، خذ 100 مل من الثقافة وأجهزة الطرد المركزي عند 4650 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد الطرد المركزي ، أضف 5 مل من 1 M حامض الستريك إلى المادة الطافية. استخراج مرتين مع 50 مل من خلات الإيثيل.
  4. تصفية المرحلة العضوية مع كبريتات المغنيسيوم من خلال مرشح حقنة. قم بتخزين المرحلة العضوية المفلترة عند -20 درجة مئوية.
  5. خذ قراءات طيفية عند 320 نانومتر.
    ملاحظة: نظرا لأن البيوشلين مركب غير مستقر للغاية في درجة حرارة الغرفة ، فقم بإجراء عملية الاستخراج على الجليد. استخدم حقنة معقمة سعة 50 مل لفصل الفلتر. ضع القطن على طرف المحقنة وأضف 1 جم من كبريتات المغنيسيوم عليه. ثبت مرشح حقنة معقم عند طرف المحقنة واجمع المرشح في أنبوب معقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قبل القياس الكمي للسيدروفورات من العزلات السريرية ، تم إجراء فحص نوعي لإنتاج siderophore لضمان إنتاج siderophores. لوحظ الكشف النوعي عن siderophores من العزلات السريرية عن طريق خطوط البكتيريا على ألواح أجار CAS. تم اختيار ثلاث عزلات سريرية ، وهي MR1 و TL7 و J3 ، جنبا إلى جنب مع PAO1 (السلالة المرجع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن هذا البروتوكول الباحثين من تحديد إجمالي siderophores واثنين من siderophores مختلفة من P. aeruginosa ، وهما pyoverdine و pyochelin ، من طاف الخلايا البكتيرية الحرة. في مقايسة ألواح أجار CAS ، تشكل صبغة CAS وأيونات Fe3+ معقدا. عندما تنتج البكتيريا siderophores ، فإنها تطفئ أيونات Fe3+ من مركب CAS-Fe3+ ، مما ي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالتمويل من DBT - برنامج تدريس التكنولوجيا الحيوية ، DBT - برنامج BUILDER و FIST. السيد شكرا الزمالة الواردة من SHODH. HP تشكر الزمالة التي تلقتها من CSIR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar Agar, Type IHIMEDIAGRM666
8-HydroxyquinolineLoba Chemie4151
Casamino AcidSRL Chemicals68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ChloroformMerck1070242521
Chrome azurol sulfonateHIMEDIARM336-10G
Citric acidMerck100241
Dextrose monohydrateMerck108342
DichloromethaneMerck107020
Ferric chloride hexahydrateHIMEDIAGRM6353
Glass FlasksBorosil5100021
Glass Test-tubesBorosil9820U05
Hydrochloric acidSDFCL20125
King's medium B baseHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimal Medium SaltsHIMEDIAG013-500G
Magnesium Sulphate Qualigens10034
MultiskanGO UV SpectrophotometerThermo Scientific51119200
Peptone Type I, BacteriologicalHIMEDIARM667-500G
PIPES free acidMP Biomedicals190257
Potassium dihydrogen phosphateMerck1048731000
Proteose peptoneHIMEDIARM005-500G
Shimadzu UV-Vis SpectrophotometerShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Sodium chlorideQualigens15915

References

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved