A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول تحليلات نوعية وكمية لإجمالي siderophores و pyoverdine و pyochelin من Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

تشتهر الزائفة الزنجارية (P. aeruginosa) بإنتاجها لمجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف. إحدى هذه الآليات هي كسح الحديد من خلال إنتاج siderophore. تنتج P. aeruginosa نوعين مختلفين: pyochelin ، الذي لديه تقارب مخلب أقل للحديد ، و pyoverdine ، الذي لديه تقارب مخلب أعلى للحديد. يوضح هذا التقرير أنه يمكن قياس البيوفيردين مباشرة من المواد الطافية البكتيرية ، بينما يحتاج البيوشلين إلى استخلاصه من المواد الطافية قبل القياس الكمي.

الطريقة الأساسية للتحليل النوعي لإنتاج siderophore هي مقايسة لوحة أجار كروم أزورول سلفونات (CAS). في هذا الفحص ، يؤدي إطلاق صبغة CAS من مركب Fe3+-Dye إلى تغيير اللون من الأزرق إلى البرتقالي ، مما يشير إلى إنتاج siderophore. من أجل القياس الكمي للسيدروفورات الكلية ، تم خلط المواد الطافية البكتيرية بنسب متساوية مع صبغة CAS في لوحة عيار ميكروي ، متبوعة بالتحليل الطيفي عند 630 نانومتر. تم قياس Pyoverdine مباشرة من المادة الطافية البكتيرية عن طريق مزجها بنسب متساوية مع 50 mM Tris-HCl ، متبوعا بالتحليل الطيفي. أكدت ذروة عند 380 نانومتر وجود البيوفيردين. أما بالنسبة ل Pyochelin ، فلم يكن القياس الكمي المباشر من الطافية البكتيرية ممكنا ، لذلك كان لا بد من استخراجه أولا. كشف التحليل الطيفي اللاحق عن وجود pyochelin ، مع ذروة عند 313 نانومتر.

Introduction

تحتاج الكائنات الحية إلى الحديد لأداء وظائف حيوية مختلفة ، مثل نقل الإلكترونات وتضاعف الحمض النووي1. من المعروف أن Pseudomonas aeruginosa ، وهو أحد مسببات الأمراض الانتهازية سالبة الجرام ، يمتلك مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة لإثبات العدوى في المضيف ، من بينها آلية واحدة هي تكوين siderophore2. خلال ظروف استنفاد الحديد ، تطلق P. aeruginosa جزيئات متخصصة تسمى siderophores ، والتي تروي الحديد من البيئة المحيطة. Siderophores يخلب الحديد خارج الخلية ، ويتم نقل مجمع ferric-siderophore الناتج بنشاط إلى الخلية3.

من المعروف أن P. aeruginosa تنتج اثنين م....

Protocol

تم الحصول على جميع العزلات البكتيرية ل P. aeruginosa من مختبرات علم الأحياء الدقيقة الطبية من فادودارا وجايبور ، الهند. تم التعامل مع جميع العزلات السريرية المختارة في خزانة السلامة الحيوية (BSL2) وتم توخي أقصى درجات الحذر أثناء التعامل مع العزلات البكتيرية أثناء التجارب. يتم توفير التفاصيل التجارية لجميع الكواشف / الحلول في جدول المواد.

1. تحضير صبغة كروم أزورول سلفونات (CAS) ووسائط أجار

  1. تحضير صبغة CAS (100 مل) بالتركيب التالي:
    1. قم بإذابة 60 مجم من CAS في 50 مل من الماء المقطر (الحل 1).
    2. قم بإذابة 2.7 مجم من FeCl3 · 6H2O في 10 مل من 10 mM HCl (محلول 2).
    3. قم....

النتائج

قبل القياس الكمي للسيدروفورات من العزلات السريرية ، تم إجراء فحص نوعي لإنتاج siderophore لضمان إنتاج siderophores. لوحظ الكشف النوعي عن siderophores من العزلات السريرية عن طريق خطوط البكتيريا على ألواح أجار CAS. تم اختيار ثلاث عزلات سريرية ، وهي MR1 و TL7 و J3 ، جنبا إلى جنب مع PAO1 (السلالة المرجع.......

Discussion

يمكن هذا البروتوكول الباحثين من تحديد إجمالي siderophores واثنين من siderophores مختلفة من P. aeruginosa ، وهما pyoverdine و pyochelin ، من طاف الخلايا البكتيرية الحرة. في مقايسة ألواح أجار CAS ، تشكل صبغة CAS وأيونات Fe3+ معقدا. عندما تنتج البكتيريا siderophores ، فإنها تطفئ أيونات Fe3+ من مركب CAS-Fe3+ ، مما ي?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بالتمويل من DBT - برنامج تدريس التكنولوجيا الحيوية ، DBT - برنامج BUILDER و FIST. السيد شكرا الزمالة الواردة من SHODH. HP تشكر الزمالة التي تلقتها من CSIR.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar Agar, Type IHIMEDIAGRM666
8-HydroxyquinolineLoba Chemie4151
Casamino AcidSRL Chemicals68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ChloroformMerck1070242521
Chrome azurol sulfonateHIMEDIARM336-10G
Citric acidMerck100241
Dextrose monohydrateMerck108342
DichloromethaneMerck107020
Ferric chloride hexahydrateHIMEDIAGRM6353
Glass FlasksBorosil5100021
Glass Test-tubesBorosil9820U05
Hydrochloric acidSDFCL20125
King's medium B baseHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimal Medium SaltsHIMEDIAG013-500G
Magnesium Sulphate Qualigens10034
MultiskanGO UV SpectrophotometerThermo Scientific51119200
Peptone Type I, BacteriologicalHIMEDIARM667-500G
PIPES free acidMP Biomedicals190257
Potassium dihydrogen phosphateMerck1048731000
Proteose peptoneHIMEDIARM005-500G
Shimadzu UV-Vis SpectrophotometerShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Sodium chlorideQualigens15915

References

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Enviro....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved