緑膿菌からのシデロフォア産生の定性的および定量的分析

要約

このプロトコルは緑 膿菌からの総siderophores、pyoverdineおよびpyochelinの質的な、量的な分析を提供する。

要約

緑膿菌 (P. aeruginosa)は、宿主に感染を確立するためにさまざまな病原性因子を産生することで知られています。そのようなメカニズムの1つは、シデロフォア生成による鉄の掃気です。 緑膿菌は 、鉄キレート親和性が低いピオケリンと、鉄キレート親和性が高いピオベルジンの2種類のシデロフォアを産生します。この報告は、ピオベルジンは細菌の上清から直接定量できるのに対し、ピオケリンは定量前に上清から抽出する必要があることを示しています。

シデロフォアの産生を定性的に分析するための主要な方法は、クロムアズロールスルホン酸(CAS)寒天プレートアッセイです。このアッセイでは、Fe³⁺-色素錯体からCAS色素が放出されると、青色からオレンジ色に色が変化し、シデロフォアの生成が示されます。総シデロフォアの定量のために、細菌上清をマイクロタイタープレートでCAS色素と等の割合で混合し、続いて630 nmで分光光度分析を行いました。ピオベルジンは、細菌上清を 50 mM Tris-HCl と等量ずつ混合し、分光光度分析を行うことにより、直接定量しました。380 nmのピークにより、ピオベルジンの存在が確認されました。ピオシュリンについては、細菌の上清から直接定量することができなかったため、最初に抽出する必要がありました。その後の分光光度分析により、313 nmにピークを持つピケリンの存在が明らかになりました。

概要

生物は、電子輸送やDNA複製など、さまざまな重要な機能を果たすために鉄を必要とします¹。 緑膿菌はグラム陰性日和見病原体であり、宿主に感染を確立する様々な病原性因子を有することが知られており、そのメカニズムの1つがシデロフォア形成^である2。鉄が枯渇すると、 緑膿菌 はシデロフォアと呼ばれる特殊な分子を放出し、周囲の環境から鉄を消光します。シデロフォアは細胞外に鉄をキレート化し、得られた鉄−シデロフォア複合体は細胞³に積極的に輸送される。

緑膿菌は、ピオベルジンとピオケリンの2つのシデロフォアを産生することが知られています。ピオベルジンは鉄キレート親和性が高い(1:1)のに対し、ピオケリンは鉄キレート親和性が低い(2:^1)ことが知られています4。ピョーシュリンは、鉄キレート親^{和性が低い}ため、二次シデロフォアとも呼ばれます5。シデロフォアの産生と調節は、緑膿菌6のクォーラムセンシング(QS)システムによって能動的に制御^{されています。}

鉄の消光に加えて、シデロフォアは病原性....

プロトコル

緑膿菌のすべての分離細菌は、インドのバドーダラとジャイプールの医療微生物学研究所から入手しました。選択されたすべての臨床分離株はバイオセーフティキャビネット(BSL2)で取り扱われ、実験中の細菌分離株の取り扱いには細心の注意が払われました。すべての試薬/溶液の商品詳細は、材料表に記載されています。

1. クロムアズロールスルホン酸(CAS)色素および寒天培地の調製

1. CAS色素(100 mL)を以下の組成で調製します。
   1. 60mgのCASを50mLの蒸留水に溶解する(溶液1)。
   2. 2.7mgのFeCl₃・6H₂Oを10mLの10mM HCl(溶液2)に溶解する。
   3. 73mgの臭化セトリモニウム(HDTMA)を40mLの蒸留水(溶液3)に溶解します。
   4. 溶液1、溶液2、溶液3を慎重に混ぜます。ガラス瓶に保管してください。
2. 以下の手順に従ってCAS寒天を調製します。
   1. 750mLの蒸留水に100mLのMM9塩溶液を加えます。
   2. 32.24gのピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸)(PIPES)遊離酸を溶解します。
   3. 寒天15gを加える。オートクレーブして冷まします。
   4. 3....

ディスカッション

このプロトコルにより、研究者は、細菌の無細胞上清から緑膿菌の総シデロフォアと2つの異なるシデロフォア、すなわちピオベルジンとピオケリンを定量化することができます。CAS寒天プレートアッセイでは、CAS色素とFe³⁺イオンが複合体を形成します。バクテリアがシデロフォアを生成すると、CAS-Fe³⁺複合体からFe³⁺イオンを消光し、バクテリアの増殖周囲に?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915