Analyse qualitative et quantitative de la production de sidérophores à partir de Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Ce protocole fournit des analyses qualitatives et quantitatives des sidérophores totaux, de la pyoverdine et de la pyochéline de Pseudomonas aeruginosa.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est connu pour sa production d’un large éventail de facteurs de virulence pour établir des infections chez l’hôte. L’un de ces mécanismes est le piégeage du fer par la production de sidérophores. P. aeruginosa produit deux sidérophores différents : la pyochéline, qui a une affinité plus faible pour chélateur du fer, et la pyoverdine, qui a une affinité plus élevée pour la chélation du fer. Ce rapport démontre que la pyoverdine peut être directement quantifiée à partir de surnageants bactériens, tandis que la pyochéline doit être extraite des surnageants avant d’être quantifiée.

La principale méthode d’analyse qualitative de la production de sidérophores est le dosage sur plaque de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS). Dans ce test, la libération du colorant CAS du complexe Fe³⁺-Dye conduit à un changement de couleur du bleu à l’orange, indiquant une production de sidérophore. Pour la quantification des sidérophores totaux, les surnageants bactériens ont été mélangés en proportions égales avec le colorant CAS dans une plaque de microtitration, suivis d’une analyse spectrophotométrique à 630 nm. La pyoverdine a été directement quantifiée à partir du surnageant bactérien en la mélangeant dans des proportions égales avec 50 mM de Tris-HCl, suivie d’une analyse spectrophotométrique. Un pic à 380 nm a confirmé la présence de pyoverdine. En ce qui concerne la pyochéline, la quantification directe à partir du surnageant bactérien n’était pas possible, il a donc fallu d’abord l’extraire. L’analyse spectrophotométrique ultérieure a révélé la présence de pyochéline, avec un pic à 313 nm.

Introduction

Les organismes ont besoin de fer pour remplir diverses fonctions vitales, telles que le transport d’électrons et la réplication de l’ADN¹. Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène opportuniste à Gram négatif, est connu pour posséder une variété de facteurs de virulence pour établir l’infection chez l’hôte, dont l’un des mécanismes est la formation de sidérophores². Dans des conditions d’appauvrissement en fer, P. aeruginosa libère des molécules spécialisées appelées sidérophores, qui éteignent le fer de l’environnement environnant. Les sidérophores chélatent le fer de manière extracellulaire, et le co....

Protocole

Tous les isolats bactériens de P. aeruginosa ont été obtenus dans des laboratoires de microbiologie médicale de Vadodara et de Jaipur, en Inde. Tous les isolats cliniques sélectionnés ont été manipulés dans une enceinte de biosécurité (BSL2) et le plus grand soin a été apporté lors de la manipulation des isolats bactériens pendant les expériences. Les détails commerciaux de tous les réactifs/solutions sont fournis dans le tableau des matériaux.

1. Préparation du colorant et du support de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS)

1. Préparer le colorant CAS (100 mL) avec la composition suivante :
   1. Diss....

Discussion

Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier les sidérophores totaux et deux sidérophores différents de P. aeruginosa, à savoir la pyoverdine et la pyochéline, à partir du surnageant bactérien acellulaire. Dans le test des plaques de gélose CAS, le colorant CAS et les ions Fe³⁺ forment un complexe. Lorsque les bactéries produisent des sidérophores, elles éteignent les ions Fe³⁺ du complexe CAS-Fe³⁺, ce qui entraîne un changement de couleur autour de la croissance .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915