Analyse qualitative et quantitative de la production de sidérophores à partir de Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Ce protocole fournit des analyses qualitatives et quantitatives des sidérophores totaux, de la pyoverdine et de la pyochéline de Pseudomonas aeruginosa.

Résumé

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est connu pour sa production d’un large éventail de facteurs de virulence pour établir des infections chez l’hôte. L’un de ces mécanismes est le piégeage du fer par la production de sidérophores. P. aeruginosa produit deux sidérophores différents : la pyochéline, qui a une affinité plus faible pour chélateur du fer, et la pyoverdine, qui a une affinité plus élevée pour la chélation du fer. Ce rapport démontre que la pyoverdine peut être directement quantifiée à partir de surnageants bactériens, tandis que la pyochéline doit être extraite des surnageants avant d’être quantifiée.

La principale méthode d’analyse qualitative de la production de sidérophores est le dosage sur plaque de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS). Dans ce test, la libération du colorant CAS du complexe Fe³⁺-Dye conduit à un changement de couleur du bleu à l’orange, indiquant une production de sidérophore. Pour la quantification des sidérophores totaux, les surnageants bactériens ont été mélangés en proportions égales avec le colorant CAS dans une plaque de microtitration, suivis d’une analyse spectrophotométrique à 630 nm. La pyoverdine a été directement quantifiée à partir du surnageant bactérien en la mélangeant dans des proportions égales avec 50 mM de Tris-HCl, suivie d’une analyse spectrophotométrique. Un pic à 380 nm a confirmé la présence de pyoverdine. En ce qui concerne la pyochéline, la quantification directe à partir du surnageant bactérien n’était pas possible, il a donc fallu d’abord l’extraire. L’analyse spectrophotométrique ultérieure a révélé la présence de pyochéline, avec un pic à 313 nm.

Introduction

Les organismes ont besoin de fer pour remplir diverses fonctions vitales, telles que le transport d’électrons et la réplication de l’ADN¹. Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène opportuniste à Gram négatif, est connu pour posséder une variété de facteurs de virulence pour établir l’infection chez l’hôte, dont l’un des mécanismes est la formation de sidérophores². Dans des conditions d’appauvrissement en fer, P. aeruginosa libère des molécules spécialisées appelées sidérophores, qui éteignent le fer de l’environnement environnant. Les sidérophores chélatent le fer de manière extracellulaire, et le complexe ferric-sidérophore qui en résulte est activement transporté vers la cellule³.

P. aeruginosa est connu pour produire deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline. La pyoverdine est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus élevée (1 :1), tandis que la pyochéline est connue pour avoir une affinité chélatrice du fer plus faible (2 :1)⁴. La pyochéline est également appelée sidérophore secondaire car elle a une^affinité chélatrice de fer 5 plus faible. La production et la régulation des sidérophores sont activement contrôlées par les systèmes de détection de quorum (QS) chez P. aeruginosa⁶.

Outre la trempe du fer, les sidérophores sont également impliqués dans la régulation des facteurs de virulence et jouent un rôle actif dans la formation du biofilm⁷. Les sidérophores jouent d’autres rôles cruciaux, notamment l’implication dans la signalisation cellulaire, la défense contre le stress oxydatif et la facilitation des interactions entre les communautés microbiennes⁸. Les sidérophores sont généralement classés en fonction des groupes fonctionnels spécifiques à travers lesquels ils chélatent le fer. Les trois principaux ligands bidentates de cette classification sont le catécholate, l’hydroxamate et le α-hydroxycarboxylate³. Les pyoverdines sont des caractéristiques d’espèces fluorescentes de Pseudomonas telles que P. aeruginosa et P. fluorescens⁵. Ils sont constitués d’un chromophore fluorescent vert mixte couplé à un oligopeptide contenant 6 à 12 acides aminés. Plusieurs peptides synthétases non ribosomales (PNR) sont impliquées dans leur synthèse⁹. Quatre gènes impliqués dans la production et la régulation de la pyoverdine sont pvdL, pvdI, pvdJ et pvdD¹⁰. La pyoverdine est également responsable de l’infection et de la virulence chez les mammifères¹¹. P. aeruginosa est connu pour produire de la pyochéline dans des conditions modérées de limitation du fer, tandis que la pyoverdine est produite dans des environnements sévères limitant le fer¹². Deux opérons impliqués dans la production de pyochéline sont pchDCBA et pchEFGHI¹³. Il est à noter qu’en présence de pyocyanine, la pyochéline (catécholate) induit des dommages oxydatifs et une inflammation et génère des radicaux hydroxyles, qui sont nocifs pour les tissus de l’hôte¹¹.

Le test du sulfonate de chrome-azurol (CAS) est largement adopté en raison de son exhaustivité, de sa grande sensibilité et de sa plus grande commodité par rapport aux tests microbiologiques, qui, bien que sensibles, peuvent être trop spécifiques¹⁴. Le test CAS peut être effectué sur des surfaces gélosées ou dans une solution. Il s’appuie sur le changement de couleur qui se produit lorsque l’ion ferrique passe de son complexe bleu intense à l’orange. Le test colorimétrique CAS quantifie l’épuisement du fer d’un complexe ternaire tensioactif Fe-CAS. Ce complexe particulier, composé de métal, de colorant organique et de tensioactif, a une couleur bleue et présente un pic d’absorption à 630 nm.

Ce rapport présente une méthode de détection qualitative de la production de sidérophores, où l’on peut détecter la production de sidérophores sur une plaque de gélose. Une méthode d’estimation quantitative de la production totale de sidérophores dans une plaque de microtitration et la détection et l’analyse quantitative de deux sidérophores, la pyoverdine et la pyochéline, de P. aeruginosa, sont également fournies.

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Protocole

Tous les isolats bactériens de P. aeruginosa ont été obtenus dans des laboratoires de microbiologie médicale de Vadodara et de Jaipur, en Inde. Tous les isolats cliniques sélectionnés ont été manipulés dans une enceinte de biosécurité (BSL2) et le plus grand soin a été apporté lors de la manipulation des isolats bactériens pendant les expériences. Les détails commerciaux de tous les réactifs/solutions sont fournis dans le tableau des matériaux.

1. Préparation du colorant et du support de gélose au sulfonate de chrome-azurol (CAS)

1. Préparer le colorant CAS (100 mL) avec la composition suivante :
   1. Dissoudre 60 mg de CAS dans 50 mL d’eau distillée (solution 1).
   2. Dissoudre 2,7 mg de FeCl₃·6H₂O dans 10 mL de 10 mM HCl (solution 2).
   3. Dissoudre 73 mg de bromure de cétrimonium (HDTMA) dans 40 mL d’eau distillée (solution 3).
   4. Mélangez soigneusement la solution 1, la solution 2 et la solution 3. Conservez-le dans une bouteille en verre.
2. Préparez la gélose CAS en suivant les étapes ci-dessous :
   1. Ajouter 100 mL de solution saline MM9 à 750 mL d’eau distillée.
   2. Dissoudre 32,24 g d’acide libre pipérazine-N,N'-bis(acide 2-éthanesulfonique) (PIPES).
   3. Ajouter 15 g d’agar-agar. Autoclaver et laisser refroidir.
   4. Ajouter 30 mL de solution stérile d’acides Casamino et 10 mL de solution stérile de glucose à 20 % au mélange.
   5. Ajoutez 100 ml de colorant CAS, mélangez et versez dans des conditions aseptiques.
      REMARQUE : La préparation du milieu MM9, de la solution d’acide Casamino et de la 8-hydroxyquinoléine est fournie dans le fichier supplémentaire 1. Le tampon PIPES est sensible au pH. Il ne se dissoudra pas tant que le pH n’aura pas atteint 5,6. Assurez-vous que le pH est constamment surveillé, car lorsque PIPES commence à se dissoudre dans l’eau, il abaisse encore le pH. Extraire l’acide Casamino avec le même volume de 3% de 8-hydroxyquinoléine dissous dans du chloroforme. Laissez la solution non miscible à 4 °C pendant environ 20 min et collectez soigneusement la phase supérieure de la solution sans perturber la phase inférieure.

2. Analyse qualitative de la production de sidérophores

1. Réglez le diamètre extérieur_{de 600} nm sur 0,2 pour les cultures cultivées de P. aeruginosa pendant 24 h.
2. À l’aide d’une boucle de fil stérile, étalez la culture bactérienne sur une plaque de gélose CAS.
3. Incuber à 30 °C pendant 24 h.
   REMARQUE : Un milieu aqueux de peptone ou une solution saline normale à 0,8 % peuvent être utilisés pour diluer la culture bactérienne. Si aucune croissance bactérienne n’est observée à 24 h, incuber les plaques CAS pendant 48 à 72 h.

3. Estimation quantitative des sidérophores totaux

1. Réinoculer des cultures de P. aeruginosa cultivées pendant 24 h dans un milieu aqueux de Peptone après avoir ajusté la DO_{de 600} nm à 0,25, et incuber à 30 °C pendant 48 h.
2. Après 48 h, centrifuger la culture bactérienne à 4650 x g pendant 10 min à température ambiante.
3. Après centrifugation, ajouter 100 μL de surnageant acellulaire à une plaque de microtitration à 96 puits et y ajouter 100 μL de colorant CAS.
4. Couvrir l’assiette de papier d’aluminium et incuber à température ambiante pendant 20 min.
5. Après incubation, prendre des mesures spectrophotométriques à 630 nm.
6. Calculer les résultats obtenus pour la quantification des sidérophores totaux en pourcentage d’unités sidérophores (PSU).
   REMARQUE : Le bloc d’alimentation peut être calculé comme suit : [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   où, A_r = absorbance de la référence à 630 nm, A_s = absorbance du surnageant acellulaire de l’échantillon. Pour référence, le colorant CAS doit être ajouté à un milieu d’eau à base de peptone non inoculé. Remplissez toute la verrerie, comme les tubes à essai, les flacons, etc., avec 6 M HCl pendant 2 h et rincez-les deux fois à l’eau distillée pour éliminer toute trace de fer dessus.

4. Estimation quantitative de la pyoverdine

1. Réinoculer des cultures de P. aeruginosa cultivées pendant 24 h dans un milieu aqueux de Peptone après avoir ajusté la DDO_{de 600} nm à 0,25 et incuber à 30 °C pendant 48 h.
2. Après 48 h, mesurer le diamètre extérieur_{de 600} nm de la croissance bactérienne avant de continuer.
3. Centrifuger la culture bactérienne à 4650 x g pendant 10 min à température ambiante.
4. Après centrifugation, ajouter 100 μL de surnageant acellulaire dans une plaque de microtitration à 96 puits et y ajouter 100 μL de Tris-HCl à 50 mM (pH 8,0).
5. Prenez des mesures spectrophotométriques à_{OD 405} nm.

5. Extraction de la pyochéline et spectrophotométrie

1. Réinoculer des cultures de P. aeruginosa cultivées pendant 24 h dans un milieu King B (Fichier supplémentaire 1) après avoir ajusté la D.O._{de 600} nm à 0,25 et incuber à 30 °C pendant 24 h.
2. Après 24 h, prélever 100 mL de culture et centrifuger à 4650 x g pendant 10 min à température ambiante.
3. Après centrifugation, ajouter 5 mL d’acide citrique 1 M au surnageant. Extraire deux fois avec 50 mL d’acétate d’éthyle.
4. Filtrez la phase organique avec du sulfate de magnésium à travers un filtre à seringue. Conserver la phase organique filtrée à -20 °C.
5. Prenez des mesures spectrophotométriques à 320 nm.
   REMARQUE : Comme la pyochéline est un composé très instable à température ambiante, effectuez le processus d’extraction sur de la glace. Utilisez une seringue stérile de 50 ml pour séparer le filtre. Placez le coton à l’extrémité de la seringue et ajoutez 1 g de sulfate de magnésium dessus. Fixez un filtre de seringue stérile à l’extrémité de la seringue et collectez le filtrat dans un tube stérile.

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Résultats

Avant la quantification des sidérophores à partir d’isolats cliniques, un criblage qualitatif de la production de sidérophores a été effectué pour assurer la production de sidérophores. La détection qualitative des sidérophores à partir d’isolats cliniques a été observée en striant des bactéries sur des plaques de gélose CAS. Trois isolats cliniques, à savoir MR1, TL7, J3, ainsi que PAO1 (la souche de référence), ont été sélectionnés pour l’étude. Les trois is...

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Discussion

Ce protocole permet aux chercheurs de quantifier les sidérophores totaux et deux sidérophores différents de P. aeruginosa, à savoir la pyoverdine et la pyochéline, à partir du surnageant bactérien acellulaire. Dans le test des plaques de gélose CAS, le colorant CAS et les ions Fe³⁺ forment un complexe. Lorsque les bactéries produisent des sidérophores, elles éteignent les ions Fe³⁺ du complexe CAS-Fe³⁺, ce qui entraîne un changement de couleur autour de la croissance ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915