ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

Summary

פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ידוע בייצור מגוון רחב של גורמי אלימות כדי לבסס זיהומים בפונדקאי. מנגנון אחד כזה הוא ניקוי ברזל באמצעות ייצור סידרופור. P. aeruginosa מייצר שני סידרופורים שונים: פיוכלין, שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל, ופיוברדין, שיש לו זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל. דו"ח זה מדגים כי ניתן לכמת פיוברדין ישירות מסופרנאטנטים חיידקיים, בעוד שפיוכלין צריך להיות מופק מסופרנאטנטים לפני הכימות.

השיטה העיקרית לניתוח איכותי של ייצור סידרופור היא בדיקת צלחת אגר כרום אזורול סולפונט (CAS). בבדיקה זו, שחרור צבע CAS מקומפלקס Fe³⁺-Dye מוביל לשינוי צבע מכחול לכתום, מה שמצביע על ייצור סידרופור. לצורך כימות הסידרופורים הכולל, סופרנאטנטים חיידקיים עורבבו בפרופורציות שוות עם צבע CAS בלוח מיקרוטיטר, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי ב-630 ננומטר. פיוברדין כומת ישירות מהסופרנאטנט החיידקי על ידי ערבובו בפרופורציות שוות עם 50 מילימטר Tris-HCl, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי. שיא של 380 ננומטר אישר את נוכחותו של pyoverdine. באשר לפיוכלין, כימות ישיר מהסופרנאטנט החיידקי לא היה אפשרי, ולכן היה צורך לחלץ אותו תחילה. ניתוח ספקטרופוטומטרי שנערך לאחר מכן גילה נוכחות של פיוכלין, עם שיא של 313 ננומטר.

Introduction

אורגניזמים זקוקים לברזל כדי לבצע פונקציות חיוניות שונות, כגון הובלת אלקטרונים ושכפול דנ"א¹. Pseudomonas aeruginosa, פתוגן אופורטוניסטי גראם-שלילי, ידוע כבעל מגוון גורמים אלימים לביסוס זיהום בפונדקאי, ביניהם מנגנון אחד הוא היווצרות סידרופור². בתנאים של דלדול ברזל, P. aeruginosa משחרר מולקולות מיוחדות שנקראות סידרופורים, אשר מרווה ברזל מהסביבה. Siderophores chelate ברזל extracellularly, ואת קומפלקס ferric-siderophore וכתוצאה מכך מועבר באופן פעיל בחזרה לתא³.

P. aeruginosa ידוע לייצר שני siderophores, pyoverdine ו pyochelin. ידוע שפיוברדין הוא בעל....

Protocol

כל המבודדים החיידקיים של P. aeruginosa התקבלו ממעבדות מיקרוביולוגיה רפואית מוואדודרה וג'איפור, הודו. כל המבודדים הקליניים שנבחרו טופלו בארון הבטיחות הביולוגית (BSL2) וננקטה זהירות מרבית בעת הטיפול במבודדים חיידקיים במהלך הניסויים. הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים/פתרונות מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת צבע כרום אזורול סולפונט (CAS) ומדיה אגר

1. הכן צבע CAS (100 מ"ל) עם הרכב הבא:
   1. יש להמיס 60 מ"ג CAS ב-50 מ"ל מים מזוקקים (תמיסה 1).
   2. יש להמיס 2.7 מ"ג של FeCl₃·6H₂O ב-10 מ"ל של 10 mM HCl (תמיסה 2).
   3. להמיס 73 מ"ג של Cetrimonium bromide (HDTMA) ב 40 מ"ל של מים מזוקקים ....

תוצאות

לפני כימות של סידרופורים ממבודדים קליניים, בוצע סינון איכותי לייצור סידרופורים כדי להבטיח ייצור סידרופורים. זיהוי איכותי של סידרופורים ממבודדים קליניים נצפה על ידי חיידקים מפוספסים על לוחות אגר CAS. שלושה מבודדים קליניים, כלומר MR1, TL7, J3, יחד עם PAO1 (זן הייחוס), נבחרו למחקר. כ?.......

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לכמת את סך כל הסידרופורים ושני סידרופורים שונים של P. aeruginosa, כלומר פיוברדין ופיוצ'לין, מהסופרנטנט נטול התאים של החיידקים. במבחן צלחות אגר CAS, צבע CAS ויוני Fe³⁺ יוצרים קומפלקס. כאשר חיידקים מייצרים סידרופורים, הם מרווים יוני Fe³⁺ מקומפלקס CAS-Fe³⁺, מה ש.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915