ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

Summary

פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ידוע בייצור מגוון רחב של גורמי אלימות כדי לבסס זיהומים בפונדקאי. מנגנון אחד כזה הוא ניקוי ברזל באמצעות ייצור סידרופור. P. aeruginosa מייצר שני סידרופורים שונים: פיוכלין, שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל, ופיוברדין, שיש לו זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל. דו"ח זה מדגים כי ניתן לכמת פיוברדין ישירות מסופרנאטנטים חיידקיים, בעוד שפיוכלין צריך להיות מופק מסופרנאטנטים לפני הכימות.

השיטה העיקרית לניתוח איכותי של ייצור סידרופור היא בדיקת צלחת אגר כרום אזורול סולפונט (CAS). בבדיקה זו, שחרור צבע CAS מקומפלקס Fe³⁺-Dye מוביל לשינוי צבע מכחול לכתום, מה שמצביע על ייצור סידרופור. לצורך כימות הסידרופורים הכולל, סופרנאטנטים חיידקיים עורבבו בפרופורציות שוות עם צבע CAS בלוח מיקרוטיטר, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי ב-630 ננומטר. פיוברדין כומת ישירות מהסופרנאטנט החיידקי על ידי ערבובו בפרופורציות שוות עם 50 מילימטר Tris-HCl, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי. שיא של 380 ננומטר אישר את נוכחותו של pyoverdine. באשר לפיוכלין, כימות ישיר מהסופרנאטנט החיידקי לא היה אפשרי, ולכן היה צורך לחלץ אותו תחילה. ניתוח ספקטרופוטומטרי שנערך לאחר מכן גילה נוכחות של פיוכלין, עם שיא של 313 ננומטר.

Introduction

אורגניזמים זקוקים לברזל כדי לבצע פונקציות חיוניות שונות, כגון הובלת אלקטרונים ושכפול דנ"א¹. Pseudomonas aeruginosa, פתוגן אופורטוניסטי גראם-שלילי, ידוע כבעל מגוון גורמים אלימים לביסוס זיהום בפונדקאי, ביניהם מנגנון אחד הוא היווצרות סידרופור². בתנאים של דלדול ברזל, P. aeruginosa משחרר מולקולות מיוחדות שנקראות סידרופורים, אשר מרווה ברזל מהסביבה. Siderophores chelate ברזל extracellularly, ואת קומפלקס ferric-siderophore וכתוצאה מכך מועבר באופן פעיל בחזרה לתא³.

P. aeruginosa ידוע לייצר שני siderophores, pyoverdine ו pyochelin. ידוע שפיוברדין הוא בעל זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל (1:1), ואילו פיוכלין ידוע כבעל זיקה פחותה לתצבית ברזל (2:1)⁴. פיוכלין נקרא גם סידרופור משני מכיוון שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל⁵. הייצור והרגולציה של סידרופורים נשלטים באופן פעיל על ידי מערכות חישת מניין (QS) ב- P. aeruginosa⁶.

מלבד מרווה ברזל, סידרופורים מעורבים גם בוויסות גורמי אלימות וממלאים תפקיד פעיל בהיווצרות ביופילם⁷. סידרופורים ממלאים תפקידים חיוניים נוספים, כולל מעורבות באיתות תאי, הגנה מפני עקה חמצונית והקלה על אינטראקציות בין קהילות מיקרוביאליות⁸. סידרופורים מסווגים בדרך כלל על בסיס הקבוצות הפונקציונליות הספציפיות שדרכן הם מכלכים ברזל. שלושת הליגנדים הדו-שינטיים העיקריים בסיווג זה הם קטכולאט, הידרוקסאמט ו-α-הידרוקסי-קרבוקסילט³. Pyoverdines הם סימני היכר של מיני Pseudomonas פלואורסצנטיים כגון P. aeruginosa ו P. fluorescens⁵. הם מורכבים מכרומופור פלואורסצנטי ירוק מעורב המחובר לאוליגופפטיד המכיל 6-12 חומצות אמינו. מספר סינתזות פפטידיות לא ריבוזומליות (NRPs) מעורבות בסינתזה שלהן⁹. ארבעה גנים המעורבים בייצור ובוויסות של פיוברדין הם pvdL, pvdI, pvdJ ו-pvdD¹⁰. פיברדין אחראי גם לזיהום ולאלימות ביונקים¹¹. P. aeruginosa ידוע לייצר pyochelin בתנאים מתונים הגבלת ברזל, בעוד pyoverdine מיוצר בסביבות חמורות הגבלת ברזל¹². שני אופרונים המעורבים בייצור פיוכלין הם pchDCBA ו-pchEFGHI¹³. יצוין כי בנוכחות pyocyanin, pyochelin (catecholate) גורם נזק חמצוני ודלקת ומייצר רדיקלים hydroxyl, אשר מזיקים לרקמות המארח¹¹.

בדיקת Chrome Azurol Sulfonate (CAS) מאומצת באופן נרחב בשל מקיפותה, רגישותה הגבוהה ונוחותה הרבה יותר בהשוואה לבדיקות מיקרוביולוגיות, אשר, למרות רגישותן, יכולות להיות ספציפיות מדי¹⁴. בדיקת CAS יכולה להתבצע על משטחי אגר או בתמיסה. הוא מסתמך על שינוי הצבע המתרחש כאשר יון הברזל עובר מהקומפלקס הכחול העז שלו לכתום. בדיקת CAS colorimetric מכמתת את דלדול הברזל מקומפלקס טרינרי Fe-CAS-surfactant. קומפלקס מסוים זה, המורכב ממתכת, צבע אורגני וחומרים פעילי שטח, הוא בעל צבע כחול ומציג שיא ספיגה של 630 ננומטר.

דו"ח זה מציג שיטה לזיהוי איכותי של ייצור סידרופורים, שבה ניתן לזהות ייצור של סידרופורים על צלחת אגר. שיטה להערכה כמותית של סך ייצור הסידרופורים בצלחת מיקרוטיטר וזיהוי וניתוח כמותי של שני סידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין, מ- P. aeruginosa, מסופקת גם כן.

Protocol

כל המבודדים החיידקיים של P. aeruginosa התקבלו ממעבדות מיקרוביולוגיה רפואית מוואדודרה וג'איפור, הודו. כל המבודדים הקליניים שנבחרו טופלו בארון הבטיחות הביולוגית (BSL2) וננקטה זהירות מרבית בעת הטיפול במבודדים חיידקיים במהלך הניסויים. הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים/פתרונות מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנת צבע כרום אזורול סולפונט (CAS) ומדיה אגר

1. הכן צבע CAS (100 מ"ל) עם הרכב הבא:
   1. יש להמיס 60 מ"ג CAS ב-50 מ"ל מים מזוקקים (תמיסה 1).
   2. יש להמיס 2.7 מ"ג של FeCl₃·6H₂O ב-10 מ"ל של 10 mM HCl (תמיסה 2).
   3. להמיס 73 מ"ג של Cetrimonium bromide (HDTMA) ב 40 מ"ל של מים מזוקקים (תמיסה 3).
   4. ערבב בזהירות את פתרון 1, פתרון 2 ופתרון 3. אחסנו אותו בבקבוק זכוכית.
2. הכינו אגר CAS לפי השלבים הבאים:
   1. הוסף 100 מ"ל של תמיסת מלח MM9 ל 750 מ"ל של מים מזוקקים.
   2. ממיסים 32.24 גרם של חומצה חופשית פיפרזין-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES).
   3. מוסיפים 15 גרם אגר אגר. Autoclave ולאפשר לו להתקרר.
   4. הוסף 30 מ"ל של תמיסת חומצות קאמינו סטריליות ו -10 מ"ל של תמיסת גלוקוז סטרילית 20% לתערובת.
   5. מוסיפים 100 מ"ל צבע CAS, מערבבים ויוצקים בתנאים אספטיים.
      הערה: הכנת מדיה MM9, תמיסת חומצות קאמינו ו- 8-הידרוקסיקינולין מסופקים בקובץ משלים 1. מאגר PIPES רגיש ל- pH. זה לא יתמוסס עד pH 5.6 מושגת. ודא כי ה- pH מנוטר כל הזמן מכיוון שכאשר PIPES מתחיל להתמוסס במים, זה יוריד עוד יותר את ה- pH. לחלץ חומצת קאמינו באותו נפח של 3% 8-hydroxyquinoline מומס כלורופורם. השאירו את התמיסה הבלתי ניתנת להפרכה על 4°C למשך כ-20 דקות ואספו בזהירות את השלב העליון של התמיסה מבלי להפריע לשלב התחתון.

2. ניתוח איכותי של ייצור סידרופורים

1. הגדר את OD₆₀₀ ננומטר ל- 0.2 עבור תרביות שגדלו ב- 24 שעות של P. aeruginosa.
2. בעזרת לולאת תיל סטרילית, פזרו את תרבית החיידקים על צלחת אגר CAS.
3. לדגור ב 30 ° C במשך 24 שעות.
   הערה: ניתן להשתמש במי פפטון או במי מלח רגילים של 0.8% כדי לדלל את תרבית החיידקים. אם לא נצפתה צמיחת חיידקים במשך 24 שעות, דגרו על לוחות CAS במשך 48 עד 72 שעות.

3. אומדן כמותי של סך הסידרופורים

1. יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במצע המים של פפטון לאחר התאמת OD₆₀₀ ננומטר ל-0.25, ולדגור ב-30°C למשך 48 שעות.
2. לאחר 48 שעות, צנטריפוגו את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של צבע CAS אליו.
4. מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
5. לאחר הדגירה, בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- 630 ננומטר.
6. חשב את התוצאות המתקבלות לכימות של סך כל הסידרופורים כיחידת סיידרופור אחוז (PSU).
   הערה: ניתן לחשב ספק כוח כ: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   כאשר,_{A r} = ספיגה של הייחוס ב 630 ננומטר, A_s = ספיגה של supernatant ללא תאים של הדגימה. לשם השוואה, יש להוסיף צבע CAS למצע מי פפטון לא מחוסנים. מלאו את כל כלי הזכוכית, כגון מבחנות, צלוחיות וכו', ב-6 M HCl למשך שעתיים ושטפו אותם פעמיים במים מזוקקים כדי להסיר כל זכר ברזל עליהם.

4. הערכה כמותית של pyoverdine

1. יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגודלו ב-24 שעות במדיית המים של פפטון לאחר התאמת OD₆₀₀ ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C במשך 48 שעות.
2. לאחר 48 שעות, מדדו את OD₆₀₀ ננומטר של צמיחת החיידקים לפני שתמשיכו הלאה.
3. צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) אליו.
5. בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- OD₄₀₅ nm.

5. מיצוי פיוכלין וספקטרופוטומטריה

1. יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במדיה של King's B (קובץ משלים 1) לאחר התאמת OD₆₀₀ ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C למשך 24 שעות.
2. לאחר 24 שעות, קח 100 מ"ל של תרבית וצנטריפוגה ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לאחר הצנטריפוגה, להוסיף 5 מ"ל של 1 M חומצת לימון supernatant. לחלץ פעמיים עם 50 מ"ל של אתיל אצטט.
4. מסננים את השלב האורגני עם מגנזיום גופרתי דרך מסנן מזרק. אחסנו את הפאזה האורגנית המסוננת בטמפרטורה של -20°C.
5. בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ברזולוציה של 320 ננומטר.
   הערה: מכיוון שפיוכלין היא תרכובת מאוד לא יציבה בטמפרטורת החדר, בצע את תהליך המיצוי על קרח. השתמש מזרק סטרילי 50 מ"ל להפרדת המסנן. מניחים כותנה בקצה המזרק ומוסיפים עליו 1 גרם מגנזיום גופרתי. מקבעים מסנן מזרק סטרילי בקצה המזרק ואוספים את התסנין בצינור סטרילי.

תוצאות

לפני כימות של סידרופורים ממבודדים קליניים, בוצע סינון איכותי לייצור סידרופורים כדי להבטיח ייצור סידרופורים. זיהוי איכותי של סידרופורים ממבודדים קליניים נצפה על ידי חיידקים מפוספסים על לוחות אגר CAS. שלושה מבודדים קליניים, כלומר MR1, TL7, J3, יחד עם PAO1 (זן הייחוס), נבחרו למחקר. כ?...

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לכמת את סך כל הסידרופורים ושני סידרופורים שונים של P. aeruginosa, כלומר פיוברדין ופיוצ'לין, מהסופרנטנט נטול התאים של החיידקים. במבחן צלחות אגר CAS, צבע CAS ויוני Fe³⁺ יוצרים קומפלקס. כאשר חיידקים מייצרים סידרופורים, הם מרווים יוני Fe³⁺ מקומפלקס CAS-Fe³⁺, מה ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915