Analisi qualitativa e quantitativa della produzione di siderofori da Pseudomonas aeruginosa

Riepilogo

Questo protocollo fornisce analisi sia qualitative che quantitative dei siderofori totali, della pioverdina e della piochelina di Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è noto per la sua produzione di una vasta gamma di fattori di virulenza per stabilire infezioni nell'ospite. Uno di questi meccanismi è l'eliminazione del ferro attraverso la produzione di siderofori. P. aeruginosa produce due diversi siderofori: la piochelina, che ha una minore affinità ferrochelante, e la pioverdina, che ha una maggiore affinità ferro-chelante. Questo rapporto dimostra che la pioverdina può essere quantificata direttamente dai surnatanti batterici, mentre la piochelina deve essere estratta dai surnatanti prima della quantificazione.

Il metodo principale per analizzare qualitativamente la produzione di siderofori è il test su piastra di agar con cromo azurolo solfonato (CAS). In questo saggio, il rilascio di colorante CAS dal complesso Fe³⁺-Dye porta a un cambiamento di colore dal blu all'arancione, indicando la produzione di siderofori. Per la quantificazione dei siderofori totali, i surnatanti batterici sono stati miscelati in proporzioni uguali con il colorante CAS in una piastra per microtitolazione, seguita da un'analisi spettrofotometrica a 630 nm. La pioverdina è stata quantificata direttamente dal surnatante batterico miscelandolo in proporzioni uguali con 50 mM Tris-HCl, seguita da analisi spettrofotometrica. Un picco a 380 nm ha confermato la presenza di pioverdina. Per quanto riguarda la piochelina, non è stato possibile quantificarla direttamente dal surnatante batterico, quindi è stato necessario estrarla prima. Successive analisi spettrofotometriche hanno rivelato la presenza di piochelina, con un picco a 313 nm.

Introduzione

Gli organismi hanno bisogno di ferro per svolgere varie funzioni vitali, come il trasporto di elettroni e la replicazione del DNA¹. Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunista Gram-negativo, è noto per possedere una varietà di fattori di virulenza per stabilire l'infezione nell'ospite, tra cui un meccanismo è la formazione di siderofori². Durante le condizioni di esaurimento del ferro, P. aeruginosa rilascia molecole specializzate chiamate siderofori, che estinguono il ferro dall'ambiente circostante. I siderofori chelano il ferro extracellulare e il complesso ferrico-sideroforo risultante viene attivamente trasportato nella cellula³.

P. aeruginosa è nota per produrre due siderofori, la pioverdina e la piochelina. La pioverdina è nota per avere una maggiore affinità chelante del ferro (1:1), mentre la piochelina è nota per avere una minore affinità chelante del ferro (2:1)⁴. La piochelina è anche chiamata sideroforo secondario perché ha una minore affinità chelante del ferro⁵. La produzione e la regolazione dei siderofori sono attivamente controllate da sistemi di Quorum Sensing (QS) in P. aeruginosa⁶.

Oltre alla tempra del ferro, i siderofori sono anche coinvolti nella regolazione dei fattori di virulenza e svolgono un ruolo attivo nella formazione del biofilm⁷. I siderofori svolgono ulteriori ruoli cruciali, tra cui il coinvolgimento nella segnalazione cellulare, la difesa contro lo stress ossidativo e la facilitazione delle interazioni tra le comunità microbiche⁸. I siderofori sono tipicamente classificati in base ai gruppi funzionali specifici attraverso i quali chelano il ferro. I tre ligandi bidentati primari in questa classificazione sono il catecolato, l'idrossiammato e il α-idrossicarbossilato³. Le pioverdine sono segni distintivi delle specie fluorescenti di Pseudomonas come P. aeruginosa e P. fluorescens⁵. Sono costituiti da un cromoforo fluorescente verde misto accoppiato ad un oligopeptide contenente 6-12 amminoacidi. Diverse peptidi sintetasi non ribosomiali (NRP) sono coinvolte nella loro sintesi⁹. Quattro geni coinvolti nella produzione e nella regolazione della pioverdina sono pvdL, pvdI, pvdJ e pvdD¹⁰. La pioverdina è anche responsabile dell'infezione e della virulenza nei mammiferi¹¹. È noto che P. aeruginosa produce piochelina in condizioni moderatamente limitanti il ferro, mentre la pioverdina viene prodotta in ambienti severi che limitano il ferro¹². Due operoni coinvolti nella produzione di piochelina sono pchDCBA e pchEFGHI¹³. Si noti che in presenza di piocianina, la piochelina (catecolato) induce danno ossidativo e infiammazione e genera radicali ossidrilici, dannosi per i tessuti dell'ospite¹¹.

Il test del cromo azurolo solfonato (CAS) è ampiamente adottato grazie alla sua completezza, all'elevata sensibilità e alla maggiore praticità rispetto ai saggi microbiologici che, sebbene sensibili, possono essere eccessivamente specifici¹⁴. Il test CAS può essere condotto su superfici di agar o in soluzione. Si basa sul cambiamento di colore che si verifica quando lo ione ferrico passa dal suo complesso blu intenso all'arancione. Il test colorimetrico CAS quantifica l'esaurimento del ferro da un complesso ternario Fe-CAS-tensioattivo. Questo particolare complesso, costituito da metallo, colorante organico e tensioattivo, ha un colore blu e presenta un picco di assorbimento a 630 nm.

Questo rapporto presenta un metodo per la rilevazione qualitativa della produzione di siderofori, in cui è possibile rilevare la produzione di siderofori su una piastra di agar. Viene inoltre fornito un metodo per la stima quantitativa della produzione totale di siderofori in una piastra per microtitolazione e la rilevazione e l'analisi quantitativa di due siderofori, pioverdina e piochelina, da P. aeruginosa.

Protocollo

Tutti gli isolati batterici di P. aeruginosa sono stati ottenuti da laboratori di microbiologia medica di Vadodara e Jaipur, in India. Tutti gli isolati clinici selezionati sono stati manipolati in un gabinetto di biosicurezza (BSL2) e durante gli esperimenti è stata prestata la massima attenzione durante la manipolazione degli isolati batterici. I dettagli commerciali di tutti i reagenti/soluzioni sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del colorante Chrome Azurol Sulfonate (CAS) e dei terreni di agar

1. Preparare il colorante CAS (100 mL) con la seguente composizione:
   1. Sciogliere 60 mg di CAS in 50 mL di acqua distillata (Soluzione 1).
   2. Sciogliere 2,7 mg di FeCl₃·6H₂O in 10 mL di HCl 10 mM (soluzione 2).
   3. Sciogliere 73 mg di bromuro di cetrimonio (HDTMA) in 40 ml di acqua distillata (soluzione 3).
   4. Mescola con cura la soluzione 1, la soluzione 2 e la soluzione 3. Conservalo in una bottiglia di vetro.
2. Preparare l'agar CAS seguendo i passaggi seguenti:
   1. Aggiungere 100 mL di soluzione salina MM9 a 750 mL di acqua distillata.
   2. Sciogliere 32,24 g di acido libero piperazina-N,N'-bis(acido 2-etanesolfonico) (PIPES).
   3. Aggiungere 15 g di agar agar. Sterilizzare in autoclave e lasciar raffreddare.
   4. Aggiungere alla miscela 30 mL di soluzione sterile di Casaminoacido e 10 mL di soluzione sterile di glucosio al 20%.
   5. Aggiungere 100 mL di colorante CAS, mescolare e versare in condizioni asettiche.
      NOTA: La preparazione del terreno MM9, della soluzione di casaminoacido e dell'8-idrossichinolina è fornita nel file supplementare 1. Il tampone PIPES è sensibile al pH. Non si dissolverà fino a quando non verrà raggiunto il pH 5,6. Assicurarsi che il pH sia costantemente monitorato perché quando PIPES inizia a dissolversi in acqua, abbasserà ulteriormente il pH. Estrarre Casaminoacido con lo stesso volume di 8-idrossichinolina al 3% disciolto in cloroformio. Lasciare la soluzione immiscibile a 4 °C per circa 20 minuti e raccogliere con cura la fase superiore della soluzione senza disturbare la fase inferiore.

2. Analisi qualitativa della produzione di siderofori

1. Impostare l'OD₆₀₀ nm su 0,2 per colture coltivate di 24 ore di P. aeruginosa.
2. Utilizzando un anello di filo sterile, strisciare la coltura batterica su una piastra di agar CAS.
3. Incubare a 30 °C per 24 ore.
   NOTA: Per diluire la coltura batterica è possibile utilizzare un terreno con acqua peptonica o soluzione salina normale allo 0,8%. Se non si osserva alcuna crescita batterica a 24 ore, incubare le piastre CAS per 48-72 ore.

3. Stima quantitativa dei siderofori totali

1. Re-inoculare colture di P. aeruginosa cresciute per 24 ore in terreno acquoso peptonico dopo aver regolato OD₆₀₀ nm a 0,25 e incubare a 30 °C per 48 ore.
2. Dopo 48 ore, centrifugare la coltura batterica a 4650 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo la centrifugazione, aggiungere 100 μL di surnatante privo di cellule a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti e aggiungervi 100 μL di colorante CAS.
4. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
5. Dopo l'incubazione, effettuare letture spettrofotometriche a 630 nm.
6. Calcolare i risultati ottenuti per la quantificazione dei siderofori totali come unità siderofora percentuale (PSU).
   NOTA: L'alimentatore può essere calcolato come: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   dove, A_r = assorbanza del riferimento a 630 nm, A_s = assorbanza del surnatante libero da cellule del campione. Per riferimento, il colorante CAS deve essere aggiunto a terreni acquosi peptonici non inoculati. Riempire tutta la vetreria, come provette, palloni, ecc., con 6 M HCl per 2 ore e sciacquarla due volte con acqua distillata per rimuovere ogni traccia di ferro su di essa.

4. Stima quantitativa della pioverdina

1. Re-inoculare colture di P. aeruginosa coltivate per 24 ore in terreno acquoso Peptone dopo aver regolato OD₆₀₀ nm a 0,25 e incubare a 30 °C per 48 ore.
2. Dopo 48 ore, misurare l'OD₆₀₀ nm della crescita batterica prima di procedere ulteriormente.
3. Centrifugare la coltura batterica a 4650 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Dopo la centrifugazione, aggiungere 100 μL di surnatante privo di cellule a una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti e aggiungervi 100 μL di Tris-HCl da 50 mM (pH 8,0).
5. Effettuare letture spettrofotometriche a OD₄₀₅ nm.

5. Estrazione della piochelina e spettrofotometria

1. Re-inoculare colture di P. aeruginosa coltivate per 24 ore nel terreno King's B (File supplementare 1) dopo aver regolato OD₆₀₀ nm a 0,25 e incubare a 30 °C per 24 ore.
2. Dopo 24 ore, prelevare 100 ml di coltura e centrifugare a 4650 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo la centrifugazione, aggiungere 5 mL di acido citrico 1 M al surnatante. Estrarre due volte con 50 ml di acetato di etile.
4. Filtrare la fase organica con solfato di magnesio attraverso un filtro a siringa. Conservare la fase organica filtrata a -20 °C.
5. Effettuare letture spettrofotometriche a 320 nm.
   NOTA: Poiché la piochelina è un composto altamente instabile a temperatura ambiente, eseguire il processo di estrazione su ghiaccio. Utilizzare una siringa sterile da 50 ml per la separazione del filtro. Posizionare del cotone sulla punta della siringa e aggiungere 1 g di solfato di magnesio. Fissare un filtro per siringa sterile sulla punta della siringa e raccogliere il filtrato in una provetta sterile.

Risultati

Prima della quantificazione dei siderofori da isolati clinici, è stato effettuato uno screening qualitativo per la produzione di siderofori per garantire la produzione di siderofori. La rilevazione qualitativa dei siderofori da isolati clinici è stata osservata striando i batteri su piastre di agar CAS. Per lo studio sono stati selezionati tre isolati clinici, ovvero MR1, TL7, J3, insieme a PAO1 (il ceppo di riferimento). Tutti e tre gli isolati clinici e PAO1 hanno mostrato risultati p...

Discussione

Questo protocollo consente ai ricercatori di quantificare i siderofori totali e due diversi siderofori di P. aeruginosa, vale a dire la pioverdina e la piochelina, dal surnatante batterico privo di cellule. Nel saggio su piastre di agar CAS, il colorante CAS e gli ioni Fe³⁺ formano un complesso. Quando i batteri producono siderofori, estinguono gli ioni Fe³⁺ dal complesso CAS-Fe³⁺, portando a un cambiamento di colore intorno alla crescita batterica. Questo cambiamento si traduce ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915