Analisi qualitativa e quantitativa della produzione di siderofori da Pseudomonas aeruginosa

Riepilogo

Questo protocollo fornisce analisi sia qualitative che quantitative dei siderofori totali, della pioverdina e della piochelina di Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) è noto per la sua produzione di una vasta gamma di fattori di virulenza per stabilire infezioni nell'ospite. Uno di questi meccanismi è l'eliminazione del ferro attraverso la produzione di siderofori. P. aeruginosa produce due diversi siderofori: la piochelina, che ha una minore affinità ferrochelante, e la pioverdina, che ha una maggiore affinità ferro-chelante. Questo rapporto dimostra che la pioverdina può essere quantificata direttamente dai surnatanti batterici, mentre la piochelina deve essere estratta dai surnatanti prima della quantificazione.

Il metodo principale per analizzare qualitativamente la produzione di siderofori è il test su piastra di agar con cromo azurolo solfonato (CAS). In questo saggio, il rilascio di colorante CAS dal complesso Fe³⁺-Dye porta a un cambiamento di colore dal blu all'arancione, indicando la produzione di siderofori. Per la quantificazione dei siderofori totali, i surnatanti batterici sono stati miscelati in proporzioni uguali con il colorante CAS in una piastra per microtitolazione, seguita da un'analisi spettrofotometrica a 630 nm. La pioverdina è stata quantificata direttamente dal surnatante batterico miscelandolo in proporzioni uguali con 50 mM Tris-HCl, seguita da analisi spettrofotometrica. Un picco a 380 nm ha confermato la presenza di pioverdina. Per quanto riguarda la piochelina, non è stato possibile quantificarla direttamente dal surnatante batterico, quindi è stato necessario estrarla prima. Successive analisi spettrofotometriche hanno rivelato la presenza di piochelina, con un picco a 313 nm.

Introduzione

Gli organismi hanno bisogno di ferro per svolgere varie funzioni vitali, come il trasporto di elettroni e la replicazione del DNA¹. Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunista Gram-negativo, è noto per possedere una varietà di fattori di virulenza per stabilire l'infezione nell'ospite, tra cui un meccanismo è la formazione di siderofori². Durante le condizioni di esaurimento del ferro, P. aeruginosa rilascia molecole specializzate chiamate siderofori, che estinguono il ferro dall'ambiente circostante. I siderofori chelano il ferro extracellulare e il complesso ferrico-sideroforo risultante viene at....

Protocollo

Tutti gli isolati batterici di P. aeruginosa sono stati ottenuti da laboratori di microbiologia medica di Vadodara e Jaipur, in India. Tutti gli isolati clinici selezionati sono stati manipolati in un gabinetto di biosicurezza (BSL2) e durante gli esperimenti è stata prestata la massima attenzione durante la manipolazione degli isolati batterici. I dettagli commerciali di tutti i reagenti/soluzioni sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del colorante Chrome Azurol Sulfonate (CAS) e dei terreni di agar

1. Preparare il colorante CAS (100 mL) con la seguente composizione:
   1. Sciogliere 60....

Discussione

Questo protocollo consente ai ricercatori di quantificare i siderofori totali e due diversi siderofori di P. aeruginosa, vale a dire la pioverdina e la piochelina, dal surnatante batterico privo di cellule. Nel saggio su piastre di agar CAS, il colorante CAS e gli ioni Fe³⁺ formano un complesso. Quando i batteri producono siderofori, estinguono gli ioni Fe³⁺ dal complesso CAS-Fe³⁺, portando a un cambiamento di colore intorno alla crescita batterica. Questo cambiamento si traduce .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915