Качественный и количественный анализ продукции сидерофоров синегнойной палочки

Резюме

Этот протокол обеспечивает как качественный, так и количественный анализ общего количества сидерофоров, пиовердина и пиохелина синегнойной палочки.

Аннотация

Синегнойная палочка (P. aeruginosa) известна тем, что вырабатывает разнообразный спектр факторов вирулентности для установления инфекций в организме хозяина. Одним из таких механизмов является поглощение железа путем производства сидерофоров. P. aeruginosa продуцирует два различных сидерофора: пиохелин, который имеет более низкое железо-хелатное сродство, и пиовердин, который имеет более высокое железо-хелатное сродство. Этот отчет демонстрирует, что пиовердин может быть непосредственно количественно определен из бактериальных надосадочных растворов, в то время как пиохелин должен быть извлечен из надосадочной жидкости перед количественным определением.

Основным методом качественного анализа производства сидерофоров является анализ агаровых пластин на основе хром-азурола сульфоната (CAS). В этом анализе высвобождение красителя CAS из комплекса Fe³⁺-Dye приводит к изменению цвета с синего на оранжевый, что указывает на образование сидерофора. Для количественного определения общего количества сидерофоров бактериальные надосадочные жидкости смешивали в равных пропорциях с красителем CAS в микротитровой пластине с последующим спектрофотометрическим анализом при длине волны 630 нм. Пиовердин определяли непосредственно из бактериальной надосадочной жидкости путем смешивания его в равных пропорциях с 50 мМ Tris-HCl с последующим спектрофотометрическим анализом. Пик на длине волны 380 нм подтвердил наличие пиовердина. Что касается Пиохелина, то прямое количественное определение из бактериальной надосадочной жидкости было невозможно, поэтому его пришлось сначала экстрагировать. Последующий спектрофотометрический анализ выявил присутствие пиохелина с пиком на 313 нм.

Введение

Организмы нуждаются в железе для выполнения различных жизненно важных функций, таких как перенос электронов и^{репликация ДНК}. Известно, что Pseudomonas aeruginosa, грамотрицательный условно-патогенный патоген, обладает различными факторами вирулентности для установления инфекции в организме хозяина, одним из механизмов которых является образование сидерофора². В условиях истощения железа P. aeruginosa высвобождает специализированные молекулы, называемые сидерофорами, которые гасят железо из окружающей среды. Сидерофоры хелатируют железо внеклеточно, и образующийся железо-сидерофорный комплекс активно транспортируется обратно в клетку³.

Известно, что P. aeruginosa продуцирует два сидерофора: пиовердин и пиохелин. Известно, что пиовердин обладает более высоким хелатным сродством железа (1:1), тогда как пиохелин, как известно, имеет меньшее хелатное сродство железа (2:1)⁴. Пиохелина также называют вторичным сидерофором, потому что он имеет более низкое хелатное сродство железа⁵. У P. aeruginosa⁶ производство и регулирование сидерофоров активно контролируется системами Quorum Sensing (QS).

Помимо гашения железа, сидерофоры также участвуют в регуляции факторов вирулентности и играют активную роль в образовании биопленки⁷. Сидерофоры играют дополнительную важную роль, включая участие в клеточной сигнализации, защите от окислительного стресса и содействии взаимодействию между микробными сообществами⁸. Сидерофоры обычно классифицируются в зависимости от конкретных функциональных групп, через которые они хелатируют железо. Тремя основными бидентатными лигандами в этой классификации являются катехолат, гидроксамат и α-гидроксикарбоксилат³. Пиовердины являются отличительными признаками флуоресцентных видов Pseudomonas, таких как P. aeruginosa и P. fluorescens⁵. Они состоят из смешанного зеленого флуоресцентного хромофора, соединенного с олигопептидом, содержащим 6-12 аминокислот. В их синтезе участвуют несколько нерибосомных пептидных синтетаз (NRP)⁹. Четыре гена, участвующие в производстве и регуляции пиовердина, — это pvdL, pvdI, pvdJ и pvdD¹⁰. Пиовердин также отвечает за инфекцию и вирулентность у млекопитающих¹¹. Отмечается, что P. aeruginosa продуцирует пиохелин в условиях умеренного ограничения железа, в то время как пиовердин вырабатывается в тяжелых железолимитирующих средах¹². Два оперона, участвующих в выработке пиохелина, — это pchDCBA и pchEFGHI¹³. Отмечено, что в присутствии пиоцианина пиохелин (катехолаты) индуцирует окислительное повреждение и воспаление и генерирует гидроксильные радикалы, которые вредны для тканей хозяина¹¹.

Анализ на сульфонат азурола хрома (CAS) широко применяется благодаря его полноте, высокой чувствительности и большему удобству по сравнению с микробиологическими анализами, которые, хотя и чувствительны, могут быть чрезмерно специфичными¹⁴. Анализ CAS может проводиться на поверхности агара или в растворе. Он основан на изменении цвета, которое происходит, когда ион трехвалентного железа переходит от своего интенсивного синего комплекса к оранжевому. Колориметрический анализ CAS количественно определяет истощение железа из тройного комплекса Fe-CAS-поверхностно-активного вещества. Этот конкретный комплекс, состоящий из металла, органического красителя и поверхностно-активного вещества, имеет синий цвет и демонстрирует пик поглощения на длине волны 630 нм.

В настоящем докладе представлен метод качественного детектирования продукции сидерофоров, при котором можно обнаружить образование сидерофоров на агаровой пластине. Также предложен метод количественной оценки суммарной продукции сидерофоров в микротитровой пластине, а также детекции и количественного анализа двух сидерофоров, пиовердина и пиохелина, из P. aeruginosa.

протокол

Все бактериальные изоляты P. aeruginosa были получены из медицинских микробиологических лабораторий в Вадодаре и Джайпуре, Индия. Все отобранные клинические изоляты обрабатывались в шкафу биобезопасности (BSL2), и во время экспериментов применялась максимальная осторожность при обращении с бактериальными изолятами. Подробная информация обо всех реагентах/растворах приведена в таблице материалов.

1. Приготовление красителя и агаровой среды на основе сульфоната хрома (CAS)

1. Приготовьте краситель CAS (100 мл) со следующим составом:
   1. Растворите 60 мг CAS в 50 мл дистиллированной воды (раствор 1).
   2. Растворить 2,7 мг FeCl₃·_6H2Oв 10 мл 10 мМ HCl (раствор 2).
   3. Растворите 73 мг бромида цетримония (HDTMA) в 40 мл дистиллированной воды (раствор 3).
   4. Тщательно перемешайте Раствор 1, Раствор 2 и Раствор 3. Хранят его в стеклянной бутылке.
2. Приготовьте агар CAS, выполнив следующие действия:
   1. Добавьте 100 мл раствора соли MM9 в 750 мл дистиллированной воды.
   2. Растворить 32,24 г пиперазина-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES) свободной кислоты.
   3. Добавить 15 г агар-агара. Отпаркуйте в автоклав и дайте ему остыть.
   4. Добавьте в смесь 30 мл стерильного раствора касаминокислоты и 10 мл стерильного 20% раствора глюкозы.
   5. Добавьте 100 мл красителя CAS, перемешайте и залейте в асептических условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление среды MM9, раствора касаминокислоты и 8-гидроксихинолина приведено в Дополнительном файле 1. Буфер PIPES чувствителен к pH. Он не растворится до тех пор, пока не будет достигнут рН 5,6. Убедитесь, что pH постоянно контролируется, потому что, когда PIPES начнет растворяться в воде, это еще больше снизит pH. Экстракт Казаминокислоты с таким же объемом 3%-го 8-гидроксихинолина растворяют в хлороформе. Оставьте несмешивающийся раствор при температуре 4 °C примерно на 20 минут и осторожно соберите верхнюю фазу раствора, не нарушая нижнюю фазу.

2. Качественный анализ производства сидерофоров

1. Установите наружный диаметр₆₀₀ нм равным 0,2 для 24 ч выращенных культур P. aeruginosa.
2. Используя стерильную проволочную петлю, нанесите бактериальную культуру на агаровую пластину CAS.
3. Инкубируют при 30 °C в течение 24 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для разбавления бактериальной культуры можно использовать пептонную водную среду или 0,8% физиологический раствор. Если в течение 24 ч рост бактерий не наблюдается, инкубируют планшеты CAS в течение 48–72 ч.

3. Количественная оценка общего количества сидерофоров

1. Повторно высейте 24-часовые культуры P. aeruginosa в пептонные водные среды после регулировки наружного диаметра₆₀₀ нм до 0,25 и инкубируйте при 30 °C в течение 48 ч.
2. Через 48 ч центрифугируют бактериальную культуру при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. После центрифугирования добавляют 100 мкл внеклеточной надосадочной жидкости в 96-луночный микротитровый планшет и добавляют к нему 100 мкл красителя CAS.
4. Накройте тарелку алюминиевой фольгой и выдержите при комнатной температуре 20 мин.
5. После инкубации снимают спектрофотометрические показания на длине волны 630 нм.
6. Рассчитайте полученные результаты для количественной оценки общего количества сидерофоров в процентах сидерофорных единиц (PSU).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блок питания можно рассчитать как: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   где, A_r = поглощение эталона при 630 нм, A_s = поглощение бесклеточной надосадочной жидкости образца. Для справки, краситель CAS следует добавлять в неинокулированную пептную водную среду. Наполните всю стеклянную посуду, такую как пробирки, колбы и т. д., 6 M HCl в течение 2 ч и дважды промойте ее дистиллированной водой, чтобы удалить следы железа.

4. Количественная оценка пиовердина

1. Повторно инокулируют выращенные в течение 24 ч культуры P. aeruginosa в пептонные водные среды после регулировки наружного диаметра₆₀₀ нм до 0,25 и инкубируют при 30 °C в течение 48 ч.
2. Через 48 ч измерьте наружный диаметр₆₀₀ нм роста бактерий, прежде чем продолжить.
3. Центрифугируют бактериальную культуру при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
4. После центрифугирования добавляют 100 мкл бесклеточной надосадочной жидкости в 96-луночный микротитровый планшет и добавляют к нему 100 мкл 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0).
5. Снятие спектрофотометрических показаний при наружном диаметре₄₀₅ нм.

5. Экстракция пиохелина и спектрофотометрия

1. Повторно высевать выращенные в течение 24 ч культуры P. aeruginosa в среду King's B (Дополнительный файл 1) после корректировки наружного диаметра₆₀₀ нм до 0,25 и инкубировать при 30 °C в течение 24 ч.
2. Через 24 ч принимают 100 мл культуры и центрифугируют при 4650 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. После центрифугирования добавляют в надосадочную жидкость 5 мл 1 М лимонной кислоты. Дважды экстрагируйте 50 мл этилацетата.
4. Органическую фазу с сульфатом магния процеживают через шприцевой фильтр. Отфильтрованную органическую фазу хранить при температуре -20 °C.
5. Снимают спектрофотометрические показания на длине волны 320 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку пиохелин является очень нестабильным соединением при комнатной температуре, выполняйте процесс экстракции на льду. Используйте стерильный шприц объемом 50 мл для разделения фильтра. Положите вату на кончик шприца и добавьте на нее 1 г сульфата магния. Закрепите стерильный шприцевой фильтр на кончике шприца и соберите фильтрат в стерильную пробирку.

Результаты

Перед количественным определением сидерофоров из клинических изолятов был проведен качественный скрининг на продукцию сидерофоров, чтобы обеспечить получение сидерофоров. Качественное обнаружение сидерофоров из клинических изолятов наблюдалось по полосатым бакт...

Обсуждение

Этот протокол позволяет исследователям количественно определить общее количество сидерофоров и двух различных сидерофоров P. aeruginosa, а именно пиовердина и пиохелина, из бактериальной внеклеточной надосадочной жидкости. В анализе агаровых пластин CAS краситель CAS и ионы Fe³⁺ обр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915