Pseudomonas aeruginosa'dan Siderofor Üretiminin Kalitatif ve Kantitatif Analizi

Özet

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin'in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.

Özet

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çok çeşitli virülans faktörleri üretmesiyle bilinir. Böyle bir mekanizma, siderofor üretimi yoluyla demirin temizlenmesidir. P. aeruginosa iki farklı siderofor üretir: daha düşük demir şelatlama afinitesine sahip pyochelin ve daha yüksek demir şelatlama afinitesine sahip pyoverdine. Bu rapor, pyoverdin'in bakteriyel süpernatantlardan doğrudan ölçülebildiğini, piyochelin'in ise nicelemeden önce süpernatantlardan ekstrakte edilmesi gerektiğini göstermektedir.

Siderofor üretimini kalitatif olarak analiz etmek için birincil yöntem, Krom Azurol Sülfonat (CAS) agar plakası testidir. Bu tahlilde, Fe³⁺-Boya kompleksinden CAS boyasının salınması, maviden turuncuya bir renk değişimine yol açarak siderofor üretimini gösterir. Toplam sideroforların miktar tayini için, bakteriyel süpernatantlar bir mikrotitre plakasında CAS boyası ile eşit oranlarda karıştırıldı, ardından 630 nm'de spektrofotometrik analiz yapıldı. Pyoverdine, 50 mM Tris-HCl ile eşit oranlarda karıştırılarak bakteri süpernatantından doğrudan ölçüldü ve ardından spektrofotometrik analiz yapıldı. 380 nm'de bir zirve, pyoverdine'in varlığını doğruladı. Pyochelin'e gelince, bakteriyel süpernatanttan doğrudan miktar tayini mümkün değildi, bu yüzden önce ekstrakte edilmesi gerekiyordu. Daha sonraki spektrofotometrik analiz, 313 nm'de bir tepe noktası ile piyochelin varlığını ortaya çıkardı.

Giriş

Organizmalar, elektron taşınması ve DNA replikasyonu gibi çeşitli hayati işlevleri yerine getirmek için demire ihtiyaç duyar¹. Gram-negatif fırsatçı bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa'nın, konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çeşitli virülans faktörlerine sahip olduğu bilinmektedir, bunlardan biri siderofor oluşumudur². Demir tüketen koşullar sırasında, P. aeruginosa , çevredeki demiri söndüren siderofor adı verilen özel molekülleri serbest bırakır. Sideroforlar demiri hücre dışı olarak şelatlar ve ortaya çıkan ferrik-siderofor kompleksi aktif olarak hücre^3'e geri taşınır.

P. aeruginosa'nın iki siderofor, pyoverdine ve pyochelin ürettiği bilinmektedir. Pyoverdinin daha yüksek bir demir şelatlama afinitesine (1:1) sahip olduğu bilinirken, pyochelin'in daha az demir şelatlama afinitesine (2:^{1) sahip} olduğu bilinmektedir4. Pyochelin ayrıca ikincil bir siderofor olarak da adlandırılır çünkü daha düşük bir demir şelatlama afinitesine^{sahiptir 5}. Sideroforların üretimi ve düzenlenmesi, P. aeruginosa^6'daki Çekirdek Algılama (QS) sistemleri tarafından aktif olarak kontrol edilmektedir.

Demir söndürmenin yanı sıra, sideroforlar virülans faktörlerinin düzenlenmesinde de rol oynar ve biyofilm oluşumunda aktif rol oynar⁷. Sideroforlar, hücre sinyalizasyonuna katılım, oksidatif strese karşı savunma ve mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimlerin kolaylaştırılması dahil olmak üzere ek önemli rollere hizmet eder⁸. Sideroforlar tipik olarak demiri şelatladıkları spesifik fonksiyonel gruplara göre kategorize edilir. Bu sınıflandırmadaki üç birincil iki dişli ligand, katekolat, hidroksiamat ve α-hidroksikarboksilat^3'tür. Pioverdinler, P. aeruginosa ve P. fluorescens⁵ gibi floresan Pseudomonas türlerinin ayırt edici özellikleridir. 6-12 amino asit içeren bir oligopeptide bağlı karışık bir yeşil floresan kromofordan oluşurlar. Birkaç ribozomal olmayan peptit sentetaz (NRP) sentezlerinde yer alır⁹. Pioverdin üretimi ve regülasyonunda yer alan dört gen pvdL, pvdI, pvdJ ve pvdD'dir¹⁰. Pyoverdine ayrıca memelilerde enfeksiyon ve virülanstan sorumludur¹¹. P. aeruginosa'nın orta derecede demir sınırlayıcı koşullarda pyochelin ürettiği, pyoverdin'in ise şiddetli demir sınırlayıcı ortamlarda üretildiği^{belirtilmektedir 12}. Pyochelin üretiminde yer alan iki operon pchDCBA ve pchEFGHI^13'tür. Piyosiyanin varlığında, piyochelin'in (katekolat) oksidatif hasara ve iltihaplanmaya neden olduğu ve konakçı dokulara zararlı olan hidroksil radikalleri ürettiği^{belirtilmektedir 11}.

Krom Azurol Sülfonat (CAS) testi, hassas olmasına rağmen aşırı spesifik olabilen mikrobiyolojik tahlillere kıyasla kapsamlılığı, yüksek hassasiyeti ve daha fazla rahatlığı nedeniyle yaygın olarak benimsenmiştir¹⁴. CAS testi, agar yüzeylerinde veya bir çözelti içinde gerçekleştirilebilir. Ferrik iyon yoğun mavi kompleksinden turuncuya geçtiğinde meydana gelen renk değişimine dayanır. CAS kolorimetrik testi, bir Fe-CAS-yüzey aktif madde üçlü kompleksinden demirin tükenmesini ölçer. Metal, organik boya ve yüzey aktif maddeden oluşan bu özel kompleks, mavi bir renge sahiptir ve 630 nm'de bir absorpsiyon zirvesi sergiler.

Bu rapor, bir agar plakası üzerinde siderofor üretiminin tespit edilebildiği siderofor üretiminin kalitatif tespiti için bir yöntem sunmaktadır. Bir mikrotitre plakasında toplam siderofor üretiminin kantitatif tahmini ve P. aeruginosa'dan iki sideroforun, pyoverdine ve pyochelin'in tespiti ve kantitatif analizi için bir yöntem de sağlanmıştır.

Protokol

P. aeruginosa'nın tüm bakteri izolatları, Hindistan'ın Vadodara ve Jaipur kentindeki tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarından elde edilmiştir. Seçilen tüm klinik izolatlar Biyogüvenlik Kabini'nde (BSL2) ele alındı ve deneyler sırasında bakteri izolatları kullanılırken azami özen gösterildi. Tüm reaktiflerin/çözeltilerin ticari detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Krom Azurol Sülfonat (CAS) boya ve agar ortamının hazırlanması

1. Aşağıdaki bileşimle CAS boyasını (100 mL) hazırlayın:
   1. 60 mg CAS'ı 50 mL damıtılmış suda çözün (Çözelti 1).
   2. 2.7 mg FeCl₃·6H2O'yu 10mL 10 mM HCl (Çözelti 2) içinde çözün.
   3. 73 mg Setrimonyum bromür (HDTMA) 40 mL damıtılmış suda (Çözelti 3) çözülür.
   4. Çözüm 1, Çözüm 2 ve Çözüm 3'ü dikkatlice karıştırın. Cam bir şişede saklayın.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek CAS agarını hazırlayın:
   1. 750 mL damıtılmış suya 100 mL MM9 tuz çözeltisi ekleyin.
   2. 32.24 g piperazin-N,N'-bis (2-etansülfonik asit) (PIPES) serbest asidi çözün.
   3. 15 g Agar agar ekleyin. Otoklavlayın ve soğumaya bırakın.
   4. Karışıma 30 mL steril Casamino asit çözeltisi ve 10 mL steril% 20 glikoz çözeltisi ekleyin.
   5. 100 mL CAS boyası ekleyin, karıştırın ve aseptik koşullarda dökün.
      NOT: MM9 ortamının, Kasamino asit çözeltisinin ve 8-Hidroksikinolinin hazırlanması Ek Dosya 1'de verilmiştir. PIPES tamponu pH'a duyarlıdır. PH 5.6'ya ulaşılana kadar çözünmez. PH'ın sürekli izlendiğinden emin olun, çünkü BORULAR suda çözünmeye başladığında pH'ı daha da düşürecektir. Kloroformda çözünmüş aynı hacimde% 3 8-hidroksikinolin ile Casamino asidi ekstrakte edin. Karışmayan çözeltiyi yaklaşık 20 °C'de bırakın ve alt fazı bozmadan çözeltinin üst fazını dikkatlice toplayın.

2. Siderofor üretiminin kalitatif analizi

1. 24 saat yetiştirilen P. aeruginosa kültürleri için OD₆₀₀ nm'yi 0.2'ye ayarlayın.
2. Steril bir tel halka kullanarak, bakteri kültürünü bir CAS agar plakası üzerinde çizin.
3. 30 °C'de 24 saat inkübe edin.
   NOT: Bakteri kültürünü seyreltmek için pepton su ortamı veya% 0.8 normal salin kullanılabilir. 24 saatte bakteri üremesi gözlenmezse, CAS plakalarını 48 ila 72 saat inkübe edin.

3. Toplam sideroforların kantitatif tahmini

1. OD₆₀₀ nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini Pepton su ortamında yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
2. 48 saat sonra, bakteri kültürünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'de santrifüjleyin.
3. Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatan ekleyin ve buna 100 μL CAS boyası ekleyin.
4. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
5. İnkübasyondan sonra, 630 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.
6. Toplam sideroforların nicelleştirilmesi için elde edilen sonuçları Yüzde Siderofor Birimi (PSU) olarak hesaplayın.
   NOT: PSU şu şekilde hesaplanabilir: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   burada, A_r = 630 nm'de referansın emilimi, A_s = numunenin hücresiz süpernatantının emilimi. Referans için, aşılanmamış pepton su ortamına CAS boyası eklenmelidir. Test tüpleri, mataralar vb. gibi tüm cam eşyaları 2 saat boyunca 6 M HCl ile doldurun ve üzerlerindeki demir kalıntılarını gidermek için damıtılmış suyla iki kez durulayın.

4. Pioverdinin kantitatif tahmini

1. OD₆₀₀ nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini Pepton su ortamında yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
2. 48 saat sonra, devam etmeden önce bakteri üremesinin OD₆₀₀ nm'sini ölçün.
3. Bakteri kültürünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'da santrifüjleyin.
4. Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatan ekleyin ve buna 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ekleyin.
5. OD₄₀₅ nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.

5. Piyochelin ekstraksiyonu ve spektrofotometri

1. OD₆₀₀ nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini King's B ortamında (Ek Dosya 1) yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 24 saat inkübe edin.
2. 24 saat sonra, 100 mL kültür alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'da santrifüjleyin.
3. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanıma 5 mL 1 M sitrik asit ekleyin. 50 mL Etil asetat ile iki kez ekstrakte edin.
4. Organik fazı bir şırınga filtresinden magnezyum sülfat ile süzün. Filtrelenmiş organik fazı -20 °C'de saklayın.
5. 320 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.
   NOT: Piyochelin, oda sıcaklığında oldukça kararsız bir bileşik olduğundan, ekstraksiyon işlemini buz üzerinde gerçekleştirin. Filtre ayırma için 50 mL steril şırınga kullanın. Şırınganın ucuna pamuk yerleştirin ve üzerine 1 gr magnezyum sülfat ekleyin. Şırınganın ucuna steril bir şırınga filtresi sabitleyin ve süzüntüyü steril bir tüpte toplayın.

Sonuçlar

Klinik izolatlardan sideroforların miktar tayini yapılmadan önce, siderofor üretimini sağlamak için siderofor üretimi için kalitatif bir tarama yapıldı. Klinik izolatlardan sideroforların kalitatif tespiti, CAS agar plakaları üzerinde çizgi oluşturan bakterilerle gözlenmiştir. Çalışma için MR1, TL7, J3 ve PAO1 (referans suş) olmak üzere üç klinik izolat seçildi. Her üç klinik izolat ve PAO1, mavi agar yüzeyindeki bakteri üremesinin etrafındaki berrak turuncu...

Tartışmalar

Bu protokol, araştırmacıların toplam sideroforları ve P. aeruginosa'nın iki farklı sideroforunu, yani pyoverdine ve pyochelin'i, bakteriyel hücresiz süpernatanttan ölçmelerini sağlar. CAS agar plakaları tahlilinde, CAS boyası ve Fe3⁺ iyonları bir kompleks oluşturur. Bakteriler sideroforlar ürettiğinde, CAS-Fe³⁺ kompleksinden Fe³⁺ iyonlarını söndürürler ve bakteri büyümesi etrafında bir renk değişikliğine yol açarlar. Bu değişiklik, bakteri üremesi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915