Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin'in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.

Özet

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çok çeşitli virülans faktörleri üretmesiyle bilinir. Böyle bir mekanizma, siderofor üretimi yoluyla demirin temizlenmesidir. P. aeruginosa iki farklı siderofor üretir: daha düşük demir şelatlama afinitesine sahip pyochelin ve daha yüksek demir şelatlama afinitesine sahip pyoverdine. Bu rapor, pyoverdin'in bakteriyel süpernatantlardan doğrudan ölçülebildiğini, piyochelin'in ise nicelemeden önce süpernatantlardan ekstrakte edilmesi gerektiğini göstermektedir.

Siderofor üretimini kalitatif olarak analiz etmek için birincil yöntem, Krom Azurol Sülfonat (CAS) agar plakası testidir. Bu tahlilde, Fe3+-Boya kompleksinden CAS boyasının salınması, maviden turuncuya bir renk değişimine yol açarak siderofor üretimini gösterir. Toplam sideroforların miktar tayini için, bakteriyel süpernatantlar bir mikrotitre plakasında CAS boyası ile eşit oranlarda karıştırıldı, ardından 630 nm'de spektrofotometrik analiz yapıldı. Pyoverdine, 50 mM Tris-HCl ile eşit oranlarda karıştırılarak bakteri süpernatantından doğrudan ölçüldü ve ardından spektrofotometrik analiz yapıldı. 380 nm'de bir zirve, pyoverdine'in varlığını doğruladı. Pyochelin'e gelince, bakteriyel süpernatanttan doğrudan miktar tayini mümkün değildi, bu yüzden önce ekstrakte edilmesi gerekiyordu. Daha sonraki spektrofotometrik analiz, 313 nm'de bir tepe noktası ile piyochelin varlığını ortaya çıkardı.

Giriş

Organizmalar, elektron taşınması ve DNA replikasyonu gibi çeşitli hayati işlevleri yerine getirmek için demire ihtiyaç duyar1. Gram-negatif fırsatçı bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa'nın, konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çeşitli virülans faktörlerine sahip olduğu bilinmektedir, bunlardan biri siderofor oluşumudur2. Demir tüketen koşullar sırasında, P. aeruginosa , çevredeki demiri söndüren siderofor adı verilen özel molekülleri serbest bırakır. Sideroforlar demiri hücre dışı olarak şelatlar ve ortaya çıkan ferrik-siderofor kompleksi aktif olarak hücre3'e geri taşınır.

Protokol

P. aeruginosa'nın tüm bakteri izolatları, Hindistan'ın Vadodara ve Jaipur kentindeki tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarından elde edilmiştir. Seçilen tüm klinik izolatlar Biyogüvenlik Kabini'nde (BSL2) ele alındı ve deneyler sırasında bakteri izolatları kullanılırken azami özen gösterildi. Tüm reaktiflerin/çözeltilerin ticari detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Krom Azurol Sülfonat (CAS) boya ve agar ortamının hazırlanması

  1. Aşağıdaki bileşimle CAS boyasını (100 mL) hazırlayın:
    1. 60 mg CAS'ı 50 mL damıtılmış suda çözün (Çözelti 1).
    2. 2.7 mg FeCl3·6H2O'yu 10mL 10 ....

Temsili Sonuçlar

Klinik izolatlardan sideroforların miktar tayini yapılmadan önce, siderofor üretimini sağlamak için siderofor üretimi için kalitatif bir tarama yapıldı. Klinik izolatlardan sideroforların kalitatif tespiti, CAS agar plakaları üzerinde çizgi oluşturan bakterilerle gözlenmiştir. Çalışma için MR1, TL7, J3 ve PAO1 (referans suş) olmak üzere üç klinik izolat seçildi. Her üç klinik izolat ve PAO1, mavi agar yüzeyindeki bakteri üremesinin etrafındaki berrak turuncu.......

Tartışmalar

Bu protokol, araştırmacıların toplam sideroforları ve P. aeruginosa'nın iki farklı sideroforunu, yani pyoverdine ve pyochelin'i, bakteriyel hücresiz süpernatanttan ölçmelerini sağlar. CAS agar plakaları tahlilinde, CAS boyası ve Fe3+ iyonları bir kompleks oluşturur. Bakteriler sideroforlar ürettiğinde, CAS-Fe3+ kompleksinden Fe3+ iyonlarını söndürürler ve bakteri büyümesi etrafında bir renk değişikliğine yol açarlar. Bu değişiklik, bakteri üremesi.......

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, DBT - Biyoteknoloji Öğretim Programı, DBT - BUILDER Programı ve FIST'ten fon aldığını kabul eder. MR teşekkür bursu SHODH'dan alındı. HP, CSIR'den alınan burs sayesinde teşekkür etti.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar Agar, Type IHIMEDIAGRM666
8-HydroxyquinolineLoba Chemie4151
Casamino AcidSRL Chemicals68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ChloroformMerck1070242521
Chrome azurol sulfonateHIMEDIARM336-10G
Citric acidMerck100241
Dextrose monohydrateMerck108342
DichloromethaneMerck107020
Ferric chloride hexahydrateHIMEDIAGRM6353
Glass FlasksBorosil5100021
Glass Test-tubesBorosil9820U05
Hydrochloric acidSDFCL20125
King's medium B baseHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimal Medium SaltsHIMEDIAG013-500G
Magnesium Sulphate Qualigens10034
MultiskanGO UV SpectrophotometerThermo Scientific51119200
Peptone Type I, BacteriologicalHIMEDIARM667-500G
PIPES free acidMP Biomedicals190257
Potassium dihydrogen phosphateMerck1048731000
Proteose peptoneHIMEDIARM005-500G
Shimadzu UV-Vis SpectrophotometerShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Sodium chlorideQualigens15915

Referanslar

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Enviro....

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır