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요약

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 siderophores, pyoverdine 및 pyochelin에 대한 정성적 및 정량적 분석을 모두 제공합니다.

초록

녹농균(Pseudomonas aeruginosa , P. aeruginosa)은 숙주에 감염을 일으키기 위해 다양한 독성 인자를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 siderophore 생산을 통한 철의 청소입니다. 녹농균(P. aeruginosa)은 철분 킬레이트 친화도가 낮은 피오쉐린(pyochelin)과 철 킬레이트 친화도가 높은 피오베르딘(pyoverdine)의 두 가지 다른 siderophores를 생성합니다. 이 보고서는 피오베르딘은 박테리아 상층액에서 직접 정량화할 수 있는 반면, 피오쉐린은 정량화 전에 상층액에서 추출해야 함을 보여줍니다.

사이드로포어 생산을 정성적으로 분석하기 위한 기본 방법은 CAS(Chrome Azurol Sulfonate) 한천 플레이트 분석입니다. 이 분석에서 Fe3+-Dye 복합체에서 CAS 염료가 방출되면 파란색에서 주황색으로 색상이 변경되어 siderophore 생성을 나타냅니다. 총 siderophore의 정량화를 위해 박테리아 상층액을 마이크로타이터 플레이트에서 CAS 염료와 동일한 비율로 혼합한 후 630nm에서 분광광도계 분석을 수행했습니다. Pyoverdine은 50mM Tris-HCl과 동일한 비율로 혼합하여 박테리아 상청액에서 직접 정량화 한 후 분광 광도 분석을 수행했습니다. 380nm에서의 피크는 pyoverdine의 존재를 확인했습니다. Pyochelin의 경우 박테리아 상청액에서 직접 정량화할 수 없었기 때문에 먼저 추출해야 했습니다. 후속 분광 광도계 분석은 313nm에서 피크를 가진 pyochelin의 존재를 밝혀 냈습니다.

서문

유기체는 전자 수송 및 DNA 복제와 같은 다양한 필수 기능을 수행하기 위해 철분을 필요로 합니다1. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 기회 병원체로, 숙주에 감염을 일으키는 다양한 독성 인자를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 그 중 한 가지 기전이 사이드로포어 형성(siderophore formation)이다2. 녹농균(P. aeruginosa )은 철분이 고갈되는 동안 시데로포어(siderophores)라고 하는 특수 분자를 방출하여 주변 환경으로부터 철분을 흡수합니다. 시데로포어는 철을 세포 외에서 킬레이트화하고, 생성된 철-시데로포어 복합체는 세포로 활발하게 다시 운반된다3.

녹농균(P. aeruginosa )은 피오베르딘(pyoverdine)과 피오슐린(pyochelin)이라는 두 개의 사이드로포어(siderophores)를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 피오베르딘은 철분 킬레이트 친화도가 더 높은 것으로 알려져 있는 반면(1:1), 파이오쉐린은 철분 킬레이트 친화도가 더 낮은 것으로 알려져 있습니다(2:1)4. Pyochelin은 철분 킬레이트 친화도가 낮기 때문에 2차 사이드로포어(siderophore)라고도 불린다5. siderophore의 생산 및 조절은 녹농균6의 QS(Quorum Sensing) 시스템에 의해 능동적으로 제어됩니다.

철 담금질 외에도 siderophore는 독성 인자를 조절하는 데 관여하며 생물막 형성에 적극적인 역할을 합니다7. Siderophores는 세포 신호 전달에 관여하고, 산화 스트레스에 대한 방어, 미생물 군집 간의 상호 작용 촉진 등 추가로 중요한 역할을 합니다8. Siderophores는 일반적으로 철을 킬레이트화하는 특정 작용기에 따라 분류됩니다. 이 분류에서 세 가지 주요 bidentate 리간드는 catecholate, hydroxamate 및 α-hydroxycarboxylate3입니다. Pyoverdines는 녹농균(P. aeruginosa) 및 P. 형광(P. fluorescens)과 같은 형광 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 특징이다 5. 이들은 6-12개의 아미노산을 함유하는 올리고펩타이드에 결합된 혼합된 녹색 형광 발색단으로 구성됩니다. 여러 가지 비리보솜 펩타이드 합성효소(NRP)가 합성에 관여한다9. 피오버다인 생산 및 조절에 관여하는 4가지 유전자는 pvdL, pvdI, pvdJ 및 pvdD10입니다. 피오베르딘은 또한 포유류의 감염과 독성을 담당한다11. 녹농균(P. aeruginosa)은 적당한 철분 제한 조건에서 피오슐린을 생성하는 것으로 알려져 있으며, 피오베르딘은 철분 제한 환경이 심한 환경에서 생성된다12. 피오쉐린 생산에 관여하는 두 개의 오페론은 pchDCBA와 pchEFGHI13입니다. 피오시아닌이 존재할 때, 피오첼린(카테콜레이트)은 산화적 손상과 염증을 유발하고 숙주 조직에 해로운 하이드록실 라디칼을 생성한다는 것이 주목된다11.

Chrome Azurol Sulfonate(CAS) 분석은 민감하지만 지나치게 특이적일 수 있는 미생물 분석에 비해 포괄성, 고감도 및 더 큰 편의성으로 인해 널리 채택되고 있습니다14. CAS 분석은 한천 표면 또는 용액에서 수행할 수 있습니다. 그것은 철 이온이 강렬한 파란색 복합체에서 주황색으로 전이될 때 발생하는 색상 변화에 의존합니다. CAS 비색 분석은 Fe-CAS-계면활성제 삼원 복합체에서 철의 고갈을 정량화합니다. 금속, 유기 염료 및 계면활성제로 구성된 이 특정 복합체는 파란색을 띠며 630nm에서 흡수 피크를 나타냅니다.

이 보고서는 한천 플레이트에서 시데로포어 생산을 감지할 수 있는 시데로포어 생산의 정성적 검출 방법을 제시합니다. 마이크로타이터 플레이트에서 총 사이드로포어 생산의 정량적 추정 방법과 녹농균(P. aeruginosa)의 두 가지 사이드로포어(pyoverdine)와 피오쉐린(pyochelin)의 검출 및 정량 분석도 제공됩니다.

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프로토콜

녹농균의 모든 박테리아 분리물은 인도 바도다라(Vadodara)와 자이푸르(Jaipur)의 의학 미생물학 실험실에서 얻었다. 선택된 모든 임상 분리물은 생물 안전 캐비닛(BSL2)에서 처리되었으며 실험 중 박테리아 분리물을 취급하는 동안 최대한의 주의를 기울였습니다. 모든 시약/용액의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.

1. Chrome Azurol Sulfonate (CAS) 염료 및 한천 배지의 제조

  1. 다음 조성으로 CAS 염료 (100mL)를 준비하십시오.
    1. CAS 60mg을 증류수 50mL에 녹입니다(용액 1).
    2. 2.7mg의 FeCl3·6H2O를 10mM HCl 10mL에 녹입니다(용액 2).
    3. 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide, HDTMA) 73mg을 증류수 40mL(용액 3)에 녹입니다.
    4. 솔루션 1, 솔루션 2 및 솔루션 3을 조심스럽게 혼합합니다. 유리병에 보관하십시오.
  2. 아래 단계에 따라 CAS 한천을 준비합니다.
    1. 100mL의 MM9 염 용액을 750mL의 증류수에 추가합니다.
    2. 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)(PIPES) 유리산 32.24g을 녹입니다.
    3. 우뭇가사리 15g을 넣는다. 오토클레이브하고 식히십시오.
    4. 멸균 카사미노산 용액 30mL와 멸균 20% 포도당 용액 10mL를 혼합물에 추가합니다.
    5. CAS 염료 100mL를 넣고 섞은 후 무균 상태로 붓는다.
      참고: MM9 배지, 카사미노산 용액 및 8-하이드록시퀴놀린의 제조는 보충 파일 1에 나와 있습니다. PIPES 버퍼는 pH에 민감합니다. pH 5.6에 도달할 때까지 녹지 않습니다. PIPES가 물에 용해되기 시작하면 pH가 더욱 낮아지기 때문에 pH를 지속적으로 모니터링해야 합니다. 클로로포름에 용해된 3% 8-하이드록시퀴놀린과 동일한 부피의 카사미노산을 추출합니다. 혼합되지 않는 용액을 4°C에서 약 20분 동안 그대로 두고 하상을 방해하지 않고 용액의 상부를 조심스럽게 수집합니다.

2. siderophores 생산의 정성적 분석

  1. 녹농균의 24시간 배양에 대해 OD600nm를 0.2로 설정합니다.
  2. 멸균 와이어 루프를 사용하여 CAS 한천 플레이트에 박테리아 배양액을 줄무늬로 만듭니다.
  3. 30 °C에서 24 시간 동안 배양합니다.
    참고: 펩톤수 배지 또는 0.8% 생리식염수를 사용하여 박테리아 배양을 희석할 수 있습니다. 24 시간 동안 박테리아 성장이 관찰되지 않으면 CAS 플레이트를 48-72 시간 동안 배양합니다.

3. 전체 siderophore의 정량적 추정

  1. OD600 nm를 0.25로 조정한 후 펩톤 물 배지에서 녹농균의 24시간 배양물을 다시 접종하고 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.
  2. 48시간 후 실온에서 4650 x g 에서 10분 동안 박테리아 배양액을 원심분리합니다.
  3. 원심분리 후 100μL의 cell-free 상층액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가하고 여기에 100μL의 CAS 염료를 추가합니다.
  4. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  5. 배양 후 630nm에서 분광 광도계 판독값을 취합니다.
  6. 전체 사이드로포어의 정량화를 위해 얻은 결과를 PSU(Percent Siderophore Unit)로 계산합니다.
    참고: PSU는 [(Ar - As)/Ar] x 100으로 계산할 수 있습니다.
    여기서, Ar = 630nm에서 기준의 흡광도,S = 샘플의 cell-free 상층액의 흡광도. 참고로 CAS 염료는 접종되지 않은 펩톤 물 매체에 첨가해야 합니다. 시험관, 플라스크 등과 같은 모든 유리 용기에 6M HCl을 2시간 동안 채우고 증류수로 두 번 헹구어 철분을 제거합니다.

4. 피오버딘의 정량적 추정

  1. OD600nm를 0.25로 조정한 후 펩톤 물 배지에서 녹농균의 24시간 성장 배양물을 다시 접종하고 30°C에서 48시간 동안 배양합니다.
  2. 48시간 후 더 진행하기 전에 박테리아 성장의 OD600nm 를 측정합니다.
  3. 실온에서 4650 x g 에서 10분 동안 박테리아 배양액을 원심분리합니다.
  4. 원심 분리 후 100 μL의 무 세포 상청액을 96 웰 마이크로 타이터 플레이트에 추가하고 100 μL의 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가합니다.
  5. OD405 nm에서 분광광도계를 측정합니다.

5. Pyochelin 적출과 분광광도법

  1. OD600nm를 0.25로 조정한 후 King's B 배지(보충 파일 1)에서 녹농균의 24시간 성장 배양물을 재접종하고 30°C에서 24시간 동안 배양합니다.
  2. 24시간 후 배양액 100mL를 취하고 실온에서 10분 동안 4650 x g 으로 원심분리합니다.
  3. 원심분리 후 상층액에 1M 구연산 5mL를 첨가합니다. 에틸 아세테이트 50mL로 두 번 추출합니다.
  4. 주사기 필터를 통해 황산 마그네슘으로 유기상을 여과합니다. 여과된 유기상을 -20°C에서 보관합니다.
  5. 320nm에서 분광광도계를 측정합니다.
    알림: 파이오쉐린은 실온에서 매우 불안정한 화합물이므로 얼음에서 추출 과정을 수행하십시오. 필터 분리를 위해 50mL 멸균 주사기를 사용합니다. 주사기 끝에 솜을 놓고 황산마그네슘 1g을 넣습니다. 주사기 끝에 멸균 주사기 필터를 고정하고 멸균 튜브에 여과액을 수집합니다.

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결과

임상 분리물에서 시데로포어를 정량화하기 전에, 시데로포어 생산을 보장하기 위해 시데로포어 생산에 대한 정성적 스크리닝을 수행했습니다. 임상 분리물에서 siderophore의 정성적 검출은 CAS 한천 플레이트의 줄무늬 박테리아에 의해 관찰되었습니다. 연구를 위해 MR1, TL7, J3, PAO1(참조 균주)과 함께 3개의 임상 분리물이 선택되었습니다. 세 가지 임상 분리물과 PAO1 모두 사이...

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토론

이 프로토콜을 통해 연구자들은 박테리아 cell-free 상층액에서 총 siderophore와 P. aeruginosa의 두 가지 다른 siderophore, 즉 pyoverdine 및 pyochelin을 정량할 수 있습니다. CAS 한천 플레이트 분석에서 CAS 염료와 Fe3+ 이온은 복합체를 형성합니다. 박테리아가 siderophore를 생성할 때 CAS-Fe3+ 복합체에서 Fe3+ 이온을 소멸시켜 박테리아 성장 주변의 색상 변화를 유도합니다. 이 변화는 박...

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공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program 및 FIST의 자금 지원을 인정합니다. SHODH에서 받은 MR 감사 펠로우십. HP는 CSIR로부터 받은 펠로우십에 감사를 표합니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar Agar, Type IHIMEDIAGRM666
8-HydroxyquinolineLoba Chemie4151
Casamino AcidSRL Chemicals68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ChloroformMerck1070242521
Chrome azurol sulfonateHIMEDIARM336-10G
Citric acidMerck100241
Dextrose monohydrateMerck108342
DichloromethaneMerck107020
Ferric chloride hexahydrateHIMEDIAGRM6353
Glass FlasksBorosil5100021
Glass Test-tubesBorosil9820U05
Hydrochloric acidSDFCL20125
King's medium B baseHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimal Medium SaltsHIMEDIAG013-500G
Magnesium Sulphate Qualigens10034
MultiskanGO UV SpectrophotometerThermo Scientific51119200
Peptone Type I, BacteriologicalHIMEDIARM667-500G
PIPES free acidMP Biomedicals190257
Potassium dihydrogen phosphateMerck1048731000
Proteose peptoneHIMEDIARM005-500G
Shimadzu UV-Vis SpectrophotometerShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Sodium chlorideQualigens15915

참고문헌

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