녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Siderophore 생산에 대한 정성적 및 정량적 분석

요약

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 총 siderophores, pyoverdine 및 pyochelin에 대한 정성적 및 정량적 분석을 모두 제공합니다.

초록

녹농균(Pseudomonas aeruginosa , P. aeruginosa)은 숙주에 감염을 일으키기 위해 다양한 독성 인자를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 그러한 메커니즘 중 하나는 siderophore 생산을 통한 철의 청소입니다. 녹농균(P. aeruginosa)은 철분 킬레이트 친화도가 낮은 피오쉐린(pyochelin)과 철 킬레이트 친화도가 높은 피오베르딘(pyoverdine)의 두 가지 다른 siderophores를 생성합니다. 이 보고서는 피오베르딘은 박테리아 상층액에서 직접 정량화할 수 있는 반면, 피오쉐린은 정량화 전에 상층액에서 추출해야 함을 보여줍니다.

사이드로포어 생산을 정성적으로 분석하기 위한 기본 방법은 CAS(Chrome Azurol Sulfonate) 한천 플레이트 분석입니다. 이 분석에서 Fe^3+-Dye 복합체에서 CAS 염료가 방출되면 파란색에서 주황색으로 색상이 변경되어 siderophore 생성을 나타냅니다. 총 siderophore의 정량화를 위해 박테리아 상층액을 마이크로타이터 플레이트에서 CAS 염료와 동일한 비율로 혼합한 후 630nm에서 분광광도계 분석을 수행했습니다. Pyoverdine은 50mM Tris-HCl과 동일한 비율로 혼합하여 박테리아 상청액에서 직접 정량화 한 후 분광 광도 분석을 수행했습니다. 380nm에서의 피크는 pyoverdine의 존재를 확인했습니다. Pyochelin의 경우 박테리아 상청액에서 직접 정량화할 수 없었기 때문에 먼저 추출해야 했습니다. 후속 분광 광도계 분석은 313nm에서 피크를 가진 pyochelin의 존재를 밝혀 냈습니다.

서문

유기체는 전자 수송 및 DNA 복제와 같은 다양한 필수 기능을 수행하기 위해 철분을 필요로 합니다¹. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 그람 음성 기회 병원체로, 숙주에 감염을 일으키는 다양한 독성 인자를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 그 중 한 가지 기전이 사이드로포어 형성(siderophore formation)이다². 녹농균(P. aeruginosa )은 철분이 고갈되는 동안 시데로포어(siderophores)라고 하는 특수 분자를 방출하여 주변 환경으로부터 철분을 흡수합니다. 시데로포어는 철을 세포 외에서 킬레이트화하고, 생성된 철-시데로포어 복합체는 세포로 활발하게 다시 운반된다³.

녹농균(P. aeruginosa )은 피오베르딘(pyoverdine)과 피오슐린(pyochelin)이라는 두 개의 사이드로포어(siderophores)를 생성하는 것으로 알려져 있습니다. 피오베르딘은 철분 킬레이트 친화도가 더 높은 것으로 알려져 있는 반면(1:1), 파이오쉐린은 철분 킬레이트 친화도가 더 낮은 것으로 알려져 있습니다(2:1)

프로토콜

녹농균의 모든 박테리아 분리물은 인도 바도다라(Vadodara)와 자이푸르(Jaipur)의 의학 미생물학 실험실에서 얻었다. 선택된 모든 임상 분리물은 생물 안전 캐비닛(BSL2)에서 처리되었으며 실험 중 박테리아 분리물을 취급하는 동안 최대한의 주의를 기울였습니다. 모든 시약/용액의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나와 있습니다.

1. Chrome Azurol Sulfonate (CAS) 염료 및 한천 배지의 제조

1. 다음 조성으로 CAS 염료 (100mL)를 준비하십시오.
   1. CAS 60mg을 증류수 50mL에 녹입니다(용액 1).
   2. 2.7mg의 FeCl₃·6H_2O를 10mM HCl 10mL에 녹입니다(용액 2).
   3. 세트리모늄 브로마이드(Cetrimonium bromide, HDTMA) 73mg을 증류수 40mL(용액 3)에 녹입니다.
   4. 솔루션 1, 솔루션 2 및 솔루션 3을 조심스럽게 혼합합니다. 유리병에 보관하십시오.
2. 아래 단계에 따라 CAS 한천을 준비합니다.
   1. 100mL의 MM9 염 용액을 750mL의 증류수에 추가합니다.<....

토론

이 프로토콜을 통해 연구자들은 박테리아 cell-free 상층액에서 총 siderophore와 P. aeruginosa의 두 가지 다른 siderophore, 즉 pyoverdine 및 pyochelin을 정량할 수 있습니다. CAS 한천 플레이트 분석에서 CAS 염료와 Fe³⁺ 이온은 복합체를 형성합니다. 박테리아가 siderophore를 생성할 때 CAS-Fe³⁺ 복합체에서 Fe³⁺ 이온을 소멸시켜 박테리아 성장 주변의 색상 변화를 유도합니다. 이 변화는 박.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915