إنشاء نموذج التعرض لب الفئران مع هفوة الفم الجديدة لأبحاث التهاب لب السن

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا مبسطا لإنشاء نموذج التهاب لب السن في الفئران باستخدام هفوة الفم المبتكرة ، يليها التحليل النسيجي اللاحق.

Abstract

التهاب لب السن ، وهو سبب شائع لفقدان الأسنان الطبيعي ، يؤدي إلى نخر وفقدان النشاط الحيوي في لب الأسنان الملتهب. يعد الكشف عن الآليات الكامنة وراء التهاب لب السن وعلاجه الفعال محورا مستمرا لأبحاث اللبية. لذلك ، فإن فهم العملية الالتهابية داخل لب الأسنان أمر حيوي لتحسين الحفاظ على اللب. بالمقارنة مع التجارب الأخرى في المختبر ، يقدم نموذج التهاب لب الفئران سياقا أكثر أصالة وتنوعا وراثيا لمراقبة التطور المرضي لالتهاب لب السن. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران ، على الرغم من فعاليتها من حيث التكلفة وإمكانية الوصول إليها ، يشكل صعوبات بسبب صغر حجمها وضعف التنسيق وانخفاض تحملها ، مما يعقد الإجراءات داخل الفم والأسنان. يقدم هذا البروتوكول تصميما جديدا وتطبيقا لكمامة الفم لكشف لب الفأر ، مما يسهل إجراءات أكثر كفاءة داخل الفم. هفوة الفم ، التي تتكون من قوس أسنان متاح بسهولة لمعظم أطباء الأسنان ويمكن أن تسرع بشكل كبير من التحضير الجراحي ، حتى بالنسبة للإجراءات لأول مرة. تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، وتلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين (HE) ، وتلطيخ التألق المناعي لتحديد التغيرات في التشكل والتعبير الخلوي. الهدف من هذه المقالة هو مساعدة الباحثين على إنشاء إجراء أكثر قابلية للتكرار وأقل تطلبا لإنشاء نموذج التهاب اللب باستخدام هفوة الفم الجديدة هذه.

Introduction

لب الأسنان ، وهو جزء لا يتجزأ من السن ، مسؤول عن وظائف أساسية متعددة مثل إمدادات المغذيات ، وتشكيل العاج ، والوظيفة الحسية ، وردود الفعل الدفاعية¹. ومع ذلك ، فإن لب الأسنان ، المحاط بالأنسجة الصلبة ، عرضة للإصابات والأضرار الناجمة عن التسوس العميق أو التهاب لب السن أو الصدمات أو العلاجات اللاحقة ^2,3. عدم وجود لب الأسنان الوظيفي يزيد من خطر هشاشة الأسنان⁴. علاوة على ذلك ، فإن فقدان حيوية اللب في الأسنان الدائمة الشابة يمكن أن يؤثر سلبا على نضوج الأسنان ، وتفشل تقنيات أطقم الأسنان الحالية في استعادة ردود الفعل العصبية التي يوفرها اللب^{الصحي 4}. وقد دفع هذا الوضع الباحثين إلى استكشاف حلول بديلة لإدارة اللب الملتهب بما يتجاوز مجرد الإزالة.

في عام 2007 ، بدأ موراي وآخرون تطبيق هندسة الأنسجة في علاج جذور الأسنان التجديدي ، مما أثار اهتماما متزايدا بالحفاظ على اللب وتجديده⁵. ومع ذلك ، تشكل أنسجة اللب الملتهبة تحديا حيث تطلق الخلايا عوامل التهابية مثل IL-6 ، والتي تجند الخلايا الالتهابية وتؤدي إلى نخر الخلايا وفقدان حيوية اللب ومضاعفات في الانتعاش الوظيفي ^6,7. لذلك ، فإن فهم الالتهاب وموت الخلايا المرتبط به أمر بالغ الأهمية للتقدم في الحفاظ على اللب الحيوي. هناك عدد من التجارب التي أجريت لاستكشاف البيولوجيا الجزيئية لللب الملتهب في الجسم الحي أو في المختبر ^8,9. على الرغم من أن التجارب في المختبر مثل مزارع الخلايا 2D أو 3D قد تم تطويرها لسنوات وأصبحت ناضجة وتستخدم على نطاق واسع لاختبار تفاعلات خلايا اللب مع العوامل الالتهابية ، إلا أن هذه التجارب لا يمكن أن تعكس التفاعل بين أنسجة اللب والجهاز المناعي الجهازي¹⁰. إذا كانت الظاهرة قيد الدراسة مشتقة من خلايا من أصل نسيجي آخر مثل الجهاز المناعي والأوعية الدموية والجهاز العصبي ، فإن زراعة خلايا اللب النقية ستؤدي إلى طريق مسدود. لذلك ، في التجارب في الجسم الحي ضرورية للغاية ومرجعية.

أصبحت الفئران بشكل متزايد خيارا شائعا في أبحاث الالتهابات في الجسم الحي بسبب فعاليتها من حيث التكلفة وخصوبتها العالية وحيويتها. ومع ذلك ، لا يوجد حاليا بروتوكول شامل لنموذج التهاب لب الفئران ، والذي يمكن أن يكون بمثابة مرجع. يشكل صغر حجم الفئران وحساسيتها للتحفيز تحديات كبيرة أثناء الإجراءات التجريبية. غالبا ما تتطلب مراقبة الأسنان الصغيرة المخبأة في عمق فم الفأر استخدام مجهر ناتئ ، على الرغم من الوجود الأكثر شيوعا للمجاهر المكتبية في المختبرات. يتطلب عدم وجود فتاحة الفم مساعدة من الآخرين. لمعالجة هذا الأمر ، ابتكرت المجموعة هفوة الفم باستخدام المواد المتاحة بسهولة والتي تهدف إلى توفير بروتوكول موحد وقابل للتكرار لبناء نموذج التهاب لب الفئران. توضح هذه المقالة تفاصيل الإجراء ، الذي يغطي التحضير قبل الجراحة ، والشلل ، وجراحة التعرض لللب ، وجمع العينات على الفئران C57. يوصي هذا البروتوكول باستخدام كمامة الفم ، وتوفير معلومات عن هيكلها وإنتاجها وتطبيقها لتسهيل الباحثين الآخرين في تكرار الإجراء.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية في هذه الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية لمدرسة غرب الصين لطب الأسنان ، جامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2021-125). تم الحصول على الفئران البالغة C57BL / 6 من شركة Gempharmatech Experimental Animals Company ، تشنغدو ، الصين. يندلع التاج الكامل للضرس الأول الفكي العلوي بعد 21 يوما من الولادة. يجب أن تكون الفئران للجراحة أكبر من 21 يوما مع حيوية طبيعية¹¹. هنا ، تم استخدام الفئران البالغة من العمر 6 إلى 8 أسابيع للنمذجة. الشكل 1 هو مخطط تدفق يوضح البروتوكول المستخدم.

1. التحضير قبل الجراحة (الشكل 2)

1. احصل على الأدوات التالية: مجهر مجسم ، لوحة تثبيت ، شريط طبي ، هفوة الفم ، لدغ أسنان طفيف التوغل بقطر 0.6 مم ، قبضة أسنان عالية السرعة للأسنان ، ملف 8 # C + ، وسادة تسخين ، حقنة 1 مل ، كرة قطنية معقمة ، ملقط العين.
2. الحصول على الأدوية التالية: مزيج التخدير ، مرهم بيطري.

2. إعداد هفوة الفم

1. وزن وتخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول مزيج التخدير (10٪ كيتامين هيدروكلوريد + 5٪ زيلازين + 85٪ محلول ملحي متساوي التوتر معقم) عند 0.007 مل / جم من وزن الجسم وتأكيد التخدير المناسب من خلال طريقة قرصة إصبع القدم. ضع مرهم تشحيم العيون على العينين لمنع إصابة العينين بسبب الجفاف أثناء العملية.
   ملاحظة: القبعات الطبية والأقنعة والقفازات وزرة وغيرها من الحماية الأساسية ضرورية. تأكد من أن كل من بيئة الجراحة وغرفة الماوس نظيفة وآمنة. من الضروري وجود وسادة حرارية للدعم الحراري طوال الإجراء.
2. تحضير هفوة الفم كما هو موضح أدناه (الشكل 3).
   1. احصل على المواد التالية: سلك قوس تقويم الأسنان بقطر 8 ميكرومتر ، ذو طيات ثني حلقة صغيرة ، قاطع سلك ثقيل ، قلم تحديد ، غطاء مطاطي بطول 3 مم وقطر مقطع عرضي 1 مم.
   2. أولا ، قم بتصويب السلك المقوس باليد اليسرى للتثبيت والإبهام ، ثني إصبع السبابة لليد اليمنى قليلا ضد قوس السلك. كرر هذا الإجراء عدة مرات ، وسوف يسهل الانحناء إلى الزاوية ثلاثية الأبعاد الصحيحة.
   3. استخدم ذو طيات ثني حلقة يونغ لثني الحافة العلوية (الشكل 3G ، a-i) لشبه المنحرف (الشكل 3C ، a-l-k-b) بطول حوالي 8 مم عند نقطة منتصف سلك القوس. تأكد من أن النقطة a (الشكل 3) على حافة منقار الكماة.
   4. امسك الزردية باليد اليسرى ، وقم بتثبيت الطرف الحر لسلك القوس بالإبهام الأيمن والسبابة ، وثني سلك القوس من النقطة أ لعمل زاوية حوالي 120 درجة. كرر الإجراء السابق عند النقطة i (الشكل 3G). تحقق مما إذا كان سلك القوس على مستوى واحد عن طريق وضعه على طاولة أفقية دون التحديق.
   5. اترك حوالي 9 مم من الطول على كل جانب (الشكل 3D ، a-b ، l-k) وثني الطرف الحر بزاوية 75 درجة باستخدام نفس مهارة الخطوة 2.2.4 ، مع التأكد من أن كل حافة على مستوى واحد. ثني هذه الزاوية الحادة مع طرف منقار ذو طيات.
   6. أوجد النقطة c حوالي 5 مم من النقطة b. اتبع نفس المهارة لثني زاوية 105 درجة على النقطة ج. ثني زاوية أخرى 105 درجة عند النقطة d 5 مم من النقطة c. اترك حوالي 4.5 مم من النقطة d وابحث عن النقطة e. ثني الطرف الحر عند النقطة e لتشكيل زاوية حوالي 100 -105 درجة (الشكل 3E).
      ملاحظة: كانت الفئران C57 البالغة من العمر 6-8 أسابيع التي استخدمناها حوالي 20 جم. لا يمكن أن يؤدي تباعد 5 مم إلى تشويش الفكين العلوي والسفلي للفئران دون تحريك ، ولكن أيضا لن يضغط على جلد الفئران ويسبب عدم الراحة. إذا تم استخدام أنواع أو أعمار أخرى من الفئران ، يرجى ضبط طول أجزاء c-d و i-h وفقا للوضع الفعلي (الشكل 3E ، G).
   7. ثني خافض اللسان الإضافي لجزء الفك السفلي (الشكل 3G ، j-i-h-g).
   8. تكرار خطوات الانحناء للجزء a-b-c على الجزء l-k-j. قم بتثبيت أجزاء i-k و k-j في نفس الوقت وثني الطرف الحر عند النقطة j لجعله عموديا على مستوى i-k-j. نقطة المشبك i التي تبعد 5 مم عن النقطة j ، ثني الطرف الحر لجعله موازيا لكل من مستوى i-k-j وجزء c-d (الشكل 3H).
   9. اترك طول 5 مم من النقطة i ، عند النقطة h ، ثني القوس الرأسي إلى جزء i-h ومواز لمستوى j-i-h. ابحث عن النقطة g عند 5 مم من النقطة h. المشبك j-i-h-g الطائرة وثني نهاية حرة متناظرة لجزء k-j. ثم يجب أن تكون النهاية الحرة بعد النقطة f متناظرة مع النهاية الخالية من النقاط الإلكترونية (الشكل 3H).
   10. ضع أغطية مطاطية على الطرف الحر (الشكل 3F).

3. الشلل

1. إصلاح الماوس ضعيف على لوحة التثبيت مع الأطراف المؤمنة بشريط الجلد. ضغط الأطراف الحرة من هفوة الفم مع الإبهام والسبابة.
2. إصلاح القواطع الأمامية الماوس في الأخدود شبه منحرف من ذراعين. تأكد من أن الذراع مع خافض اللسان هو للفك السفلي. اضبط كمامة الفم للتأكد من تثبيت لسان الفأر ولكن ليس نقص تروية.

4. تقييم الأسنان

1. تأكد من أن الضرس الأول الفكي العلوي للجراحة يجب أن يكون خاليا من تسوس الأسنان والصدمات وتكون الأسنان. تأكد من عدم وجود احمرار أو تورم أو ناسور على اللثة المحيطة. تأكد من أن الأسنان المقابلة صحية ومتاحة للعمل كمجموعة تحكم صحية.

5. التعرض اللب

1. استخدم نتوءات الأسنان للحفر في الجانب الإطباقي من الضرس الأول الفكي العلوي بسرعة 20000 دورة في الدقيقة. تأكد من إزالة المينا. حافظ على العملية باستخدام قبضة الأسنان فقط في طبقة ضحلة من العاج لمنع التحفيز الحراري المفرط على أنسجة لب الأسنان¹².
2. في الوقت نفسه ، منع ارتفاع درجة الحرارة باستخدام حقنة لإسقاط محلول ملحي طبيعي على السن كل 3 دقائق أثناء العملية.
3. ضع ملف 8 # أو 10 # C + على أدنى موضع للحفرة المحفورة واخترق العاج الأخير لفضح حجرة اللب. سيكون شعورا واضحا بالسقوط عند إزالة العاج المحلي تماما. لا تسبر عميقا جدا ، وإلا فقد يتم إخراج أنسجة لب الأسنان من حجرة اللب.
4. تنظيف الشظايا حول السن. خلع هفوة الفم. انتهت الجراحة. استخدم الضرس الأول الفكي المعاكس كعنصر تحكم بدون تشغيل.

6. رعاية ما بعد الجراحة

1. بعد الجراحة، يتم تطبيق كاربروفين (5 ملغ/كغ) تحت الجلد ويوضع الفأر على وسادة التسخين الحرارية الكيميائية في وضعية الانبطاح حتى الشفاء من التخدير. إطعام الفئران وتوفير مياه الشرب. يجب الإشراف على عملية الاسترداد. يجب ألا تكون أي أخرى في نفس الغرفة حتى يتم استرداد الماوس بالكامل.

7. جمع العينات وتخزينها

1. القتل الرحيم للفأر مع خلع عنق الرحم تحت حالة مخدر عميق بعد 24 ساعة من العملية أو أي نقطة زمنية أخرى حسب التجربة⁹. قطع عضلات الهيكل العظمي المرتبطة بالفك العلوي والزيجوما بمقص العيون. إزالة الهيكل العظمي والعظام الأمامية والأنسجة الرخوة واخراج الصفيحة gnathostegite مع الأضراس الفكية.
   ملاحظة: وفقا ل He et al. ، تمت الإشادة بأنه يجب جمع عينة التهاب لب السن بعد أقل من 72 ساعة بعد الجراحة لتجنب النخر الواسع في أنسجة لب الأسنان¹³.
2. قسم الغناتوستيغيت سهميا إلى نصفين وقم بتخزين الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، عند 4 درجات مئوية لتثبيت 24 ساعة.

8. التحليل النسيجي

1. اغسل الأنسجة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وقم بإزالة الكلس منها في محلول إزالة الكلس المتغير يوميا بنسبة 5٪ EDTA و 4٪ سكروز في PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 أسابيع¹⁰.
2. قم بتضمين 1/2 gnathostegite في البارافين وتأكد من أن الوجه السهمي بدون أسنان في الجزء السفلي من أشرطة الأنسجة.
3. قطع كتلة البارافين إلى شرائح بسمك 5 ميكرومتر مع ميكروتوم البارافين. اضبط زاوية كتلة البارافين وفقا للعلاقة القريبة والبعيدة والعلوية والسفلية التي لوحظت تحت المجهر لضمان إمكانية قطع لب التاج الكامل وانثقاب الضرس الأول.

النتائج

تم إجراء الإجراء الموصوف أعلاه على الضرس الأول الفكي الأيمن من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 3 ، 6-8 أسابيع ، في حين تم الحفاظ على الأضراس الأولى للفك العلوي الأيسر كعنصر تحكم. تم استخدام نتائج الأنسجة والتألق المناعي من التحكم الفارغ ، وعينات التهاب لب السن لمدة 12 ساعة و 24 ساعة من التهاب لب ...

Discussion

نظرا لأن الأنسجة الرخوة الانفرادية داخل الأسنان ، يؤدي لب الأسنان دورا مهما في الحفاظ على النشاط الحيوي للأسنان ولكنه يظل شديد الحساسية. أصبح الحفاظ على هذا اللب الحيوي هو النهج الأولي المفضل في العلاجات اللبية الحديثة ، مما يستلزم فهما شاملا للآليات الالتهابية لب الأسنان¹⁶. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.