Estabelecimento de um modelo de exposição à polpa murina com uma nova mordaça bucal para pesquisa de pulpite

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo simplificado para estabelecer um modelo de pulpite em camundongos usando um mordaça bucal inovador, seguido de análise histológica subsequente.

Resumo

A pulpite, uma causa comum de perda natural do dente, leva à necrose e perda de bioatividade na polpa dentária inflamada. Desvendar os mecanismos subjacentes à pulpite e seu tratamento eficiente é um foco contínuo da pesquisa endodôntica. Portanto, entender o processo inflamatório dentro da polpa dentária é vital para melhorar a preservação da polpa. Comparado a outros experimentos in vitro , um modelo de pulpite murina oferece um contexto mais autêntico e geneticamente diverso para observar a progressão patológica da pulpite. No entanto, o uso de camundongos, apesar de sua relação custo-benefício e acessibilidade, apresenta dificuldades devido ao seu pequeno tamanho, má coordenação e baixa tolerância, dificultando os procedimentos intrabucais e odontológicos. Este protocolo apresenta um novo design e aplicação de uma mordaça bucal para expor a polpa do camundongo, facilitando procedimentos intraorais mais eficientes. A mordaça bucal, composta por uma arcada dentária prontamente disponível para a maioria dos dentistas e pode agilizar significativamente a preparação cirúrgica, mesmo para procedimentos iniciais. Micro-CT, coloração de hematoxilina-eosina (HE) e coloração de imunofluorescência foram usadas para identificar alterações na morfologia e expressão celular. O objetivo deste artigo é ajudar os pesquisadores a estabelecer um procedimento mais reprodutível e menos exigente para criar um modelo de inflamação pulpar usando esta nova mordaça bucal.

Introdução

A polpa dentária, parte integrante do dente, é responsável por múltiplas funções essenciais, como fornecimento de nutrientes, formação de dentina, função sensorial e reações de defesa¹. No entanto, a polpa dentária, circundada por tecido duro, é suscetível a lesões e danos causados por cárie profunda, pulpite, trauma ou terapias subsequentes ^2,3. A ausência de polpa dentária funcional aumenta o risco de fragilidade dentária⁴. Além disso, a perda de vitalidade pulpar em dentes permanentes jovens pode afetar adversamente a maturação dentária, e as técnicas atuais de prótese dentária não conseguem restaurar o feedback neural oferecido pela polpa saudável⁴. Essa situação levou os pesquisadores a explorar soluções alternativas para o manejo da polpa inflamada além da mera remoção.

Em 2007, Murray et al. iniciaram a aplicação da engenharia de tecidos na endodontia regenerativa, despertando assim um interesse crescente na preservação e regeneração pulpar⁵. No entanto, o tecido pulpar inflamado representa um desafio, pois as células liberam fatores inflamatórios, como a IL-6, que recrutam células inflamatórias e resultam em necrose celular, perda de vitalidade pulpar e complicações na recuperação funcional ^6,7. Compreender a inflamação e a morte celular associada é, portanto, crucial para avanços na preservação da polpa vital. Há uma série de experimentos que foram conduzidos para explorar a biologia molecular da polpa inflamada in vivo ou in vitro ^8,9. Embora experimentos in vitro como culturas de células 2D ou 3D tenham sido desenvolvidos há anos e estejam se tornando maduros e amplamente utilizados para testar reações de células pulpares a fatores inflamatórios, esses experimentos não podem refletir a interação entre o tecido pulpar e o sistema imunológico sistêmico¹⁰. Se o fenômeno que está sendo estudado for derivado de células de outra origem tecidual, como sistema imunológico, vascular e nervoso, a cultura de células pulpares puras levará a um beco sem saída. Portanto, experimentos in vivo são muito necessários e referenciais.

Os camundongos têm se tornado cada vez mais uma escolha comum na pesquisa de inflamação in vivo devido à sua relação custo-benefício, alta fertilidade e vitalidade. No entanto, um protocolo abrangente para o modelo de pulpite de camundongos está ausente atualmente, o que pode servir como referência. O pequeno tamanho dos camundongos e sua sensibilidade à estimulação representam desafios significativos durante os procedimentos experimentais. Observar os dentes minúsculos escondidos profundamente na boca do camundongo geralmente requer o uso de um microscópio cantilever, apesar da presença mais comum de microscópios de mesa em laboratórios. A ausência de um abridor de boca requer ajuda de outras pessoas. Para resolver isso, o grupo desenvolveu uma mordaça bucal usando materiais prontamente disponíveis que visa fornecer um protocolo padronizado e reprodutível para a construção do modelo de pulpite de camundongos. Este artigo detalha o procedimento, abrangendo preparação pré-operatória, imobilização, cirurgia de exposição pulpar e coleta de amostras em camundongos C57. Esse protocolo recomenda o uso da mordaça bucal, fornecendo informações sobre sua estrutura, produção e aplicação para facilitar a replicação do procedimento por outros pesquisadores.

Protocolo

Os procedimentos experimentais neste estudo foram aprovados pelo comitê de ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-125). Camundongos C57BL/6 adultos foram obtidos da Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China. Toda a coroa do primeiro molar superior entra em erupção 21 dias após o nascimento. Os camundongos para cirurgia devem ter mais de 21 dias com vitalidade normal¹¹. Aqui, camundongos de 6 a 8 semanas de idade foram usados para modelagem. A Figura 1 é um fluxograma que mostra o protocolo utilizado.

1. Preparo pré-operatório (Figura 2)

1. Obtenha os seguintes instrumentos: microscópio estereoscópico, placa de fixação, fita médica, mordaça bucal, broca dentária minimamente invasiva com diâmetro de 0,6 mm, peça de mão odontológica odontológica de alta velocidade, lima 8# C+, almofada de aquecimento, seringa de 1 mL, bola de algodão estéril, pinça ocular.
2. Obtenha os seguintes medicamentos: mistura de anestesia, pomada veterinária.

2. Preparação da mordaça bucal

1. Pese e anestesie o camundongo por injeção intraperitoneal de solução de mistura anestésica (cloridrato de cetamina a 10% + xilazina a 5% + solução salina isotônica estéril a 85%) a 0,007 mL / g de peso corporal e confirme a anestesia adequada através do método de pinça do dedo do pé. Aplique pomada lubrificante oftálmica nos olhos para evitar lesões oculares devido à dessecação durante a operação.
   NOTA: Chapéus médicos, máscaras, luvas e macacões e outras proteções básicas são necessários. Certifique-se de que o ambiente cirúrgico e a câmara do mouse estejam limpos e seguros. É necessária uma almofada térmica para suporte térmico durante todo o procedimento.
2. Prepare o mordaça bucal conforme descrito abaixo (Figura 3).
   1. Obtenha os seguintes materiais: Fio de arco ortodôntico com diâmetro de 8 μm, alicate de dobra de laço jovem, cortador de fio pesado, caneta marcadora, tampa de borracha com comprimento de 3 mm e diâmetro de seção transversal de 1 mm.
   2. Primeiro, endireite o fio do arco com a mão esquerda para fixação e o polegar, o dedo indicador da mão direita dobre levemente contra o arco do fio. Repita esta ação várias vezes, isso facilitará a flexão para o ângulo tridimensional correto.
   3. Use o alicate de dobra de laço Yong para dobrar a borda superior (Figura 3G, ai) do trapézio (Figura 3C, al-kb) com cerca de 8 mm de comprimento no ponto médio do fio do arco. Certifique-se de que o ponto a (Figura 3) esteja na borda do bico do alicate.
   4. Segure o alicate com a mão esquerda, prenda a extremidade livre do fio do arco com o polegar direito e o indicador e dobre o fio do arco do ponto a para fazer um ângulo de cerca de 120 °. Duplique a ação anterior no ponto i (Figura 3G). Verifique se o fio do arco está em um plano, colocando-o em uma mesa horizontal sem forçar a alavanca.
   5. Deixe cerca de 9 mm de comprimento de cada lado (Figura 3D, ab, lk) e dobre a extremidade livre em um ângulo de 75 ° usando a mesma habilidade da etapa 2.2.4, garantindo que cada borda esteja em um plano. Dobre este ângulo agudo com a ponta do bico do alicate.
   6. Encontre o ponto c a cerca de 5 mm do ponto b. Siga a mesma habilidade para dobrar um ângulo de 105° no ponto c. Dobre outro ângulo de 105° no ponto d a 5 mm do ponto c. Deixe cerca de 4,5 mm do ponto d e encontre o ponto e. Dobre a extremidade livre no ponto e para formar um ângulo de cerca de 100 -105° (Figura 3E).
      NOTA: Os camundongos C57 de 6 a 8 semanas que usamos tinham cerca de 20 g. O espaçamento de 5 mm não só poderia emperrar as mandíbulas superior e inferior dos camundongos sem se mover, mas também não pressionaria a pele dos camundongos e causaria desconforto. Se outras espécies ou idades de camundongos forem usadas, ajuste o comprimento das partes cd e ih de acordo com a situação real (Figura 3E, G).
   7. Dobre um abaixador de língua extra para a parte mandibular (Figura 3G, j-i-h-g).
   8. Etapas de dobra duplicadas da peça ABC na peça LKJ. Prenda as peças i-k e k-j ao mesmo tempo e dobre a extremidade livre no ponto j para torná-la vertical em relação ao plano i-k-j. Clamp ponto i que fica a 5 mm do ponto j, dobre a extremidade livre para torná-la paralela ao plano i-k-j e à parte cd (Figura 3H).
   9. Deixe 5 mm de comprimento do ponto i, no ponto h, dobre o arco verticalmente para a parte i-h e paralelo ao plano j-i-h. Encontre o ponto g a 5 mm do ponto h. Prenda o plano j-i-h-g e dobre a extremidade livre simétrica à parte k-j. Em seguida, a extremidade livre após o ponto f deve ser simétrica à extremidade livre do ponto e (Figura 3H).
   10. Coloque tampas de borracha na extremidade livre (Figura 3F).

3. Imobilização

1. Fixe o mouse em decúbito dorsal na placa de fixação com os membros presos por fita adesiva. Comprima as pontas livres da mordaça bucal com o polegar e o indicador.
2. Fixe os incisivos frontais do mouse na ranhura trapezoidal de dois braços. Certifique-se de que o braço com abaixador de língua seja para mandibula. Ajuste a mordaça bucal para garantir que a língua do rato esteja imobilizada, mas não isquêmica.

4. Avaliação dentária

1. Certifique-se de que o primeiro molar superior para cirurgia esteja livre de cáries dentárias, traumas e odontogênese. Certifique-se de que não haja vermelhidão, inchaço ou fístula na gengiva circundante. Certifique-se de que os dentes opostos estejam saudáveis e disponíveis para atuar como o grupo de controle saudável.

5. Exposição pulpar

1. Use a broca dentária para perfurar o lado oclusal do primeiro molar superior a uma velocidade de 20.000 rpm. Certifique-se de que o esmalte seja removido. Mantenha a operação com peça de mão odontológica apenas em camada rasa de dentina para evitar estimulação térmica excessiva no tecido pulpar dentário¹².
2. Ao mesmo tempo, evite o superaquecimento usando uma seringa para colocar solução salina normal no dente a cada 3 minutos durante a operação.
3. Coloque uma lima 8# ou 10# C+ na posição mais baixa do poço perfurado e perfure a última dentina para expor a câmara pulpar. Será uma sensação óbvia de queda quando a dentina local for completamente removida. Não prob muito fundo, ou o tecido da polpa dentária pode ser retirado da câmara pulpar.
4. Limpe os fragmentos ao redor do dente. Tire a mordaça na boca; A cirurgia está terminada. Use o primeiro molar maxilar oposto como controle sem operação.

6. Cuidados pós-operatórios

1. Após a cirurgia, administre carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea e coloque o camundongo na almofada de aquecimento quimiotérmico em decúbito ventral até a recuperação da anestesia. Alimente os ratos e forneça água potável. O processo de recuperação deve ser supervisionado. Nenhum outro animal deve estar na mesma câmara até que o camundongo esteja totalmente recuperado.

7. Coleta e armazenamento de amostras

1. Eutanasiar o camundongo com luxação cervical sob condição anestésica profunda 24 h após a operação ou qualquer outro momento conforme experimento⁹. Corte os músculos do esqueleto ligados à maxila e ao zigoma com uma tesoura oftálmica. Remova o esqueleto, o osso frontal e os tecidos moles e retire a lâmina gnotosgotegita com os molares superiores.
   NOTA: De acordo com He et al., recomenda-se que a amostra de pulpite seja coletada menos de 72 h após a cirurgia para evitar necrose extensa no tecido pulpar dentário¹³.
2. Divida sagitalmente o gnatosgotegito ao meio e armazene o tecido em paraformaldeído a 4% em PBS, pH 7,4, a 4 ° C para fixação de 24 horas.

8. Análise histológica

1. Lave o tecido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e descalcifique-o em solução descalcificante alterada diariamente de EDTA a 5% e sacarose a 4% em PBS, pH 7,4, a 4 °C por 2-4 semanas¹⁰.
2. Incorpore a 1/2 gontostegita em parafina e certifique-se de que a face sagital sem dentes esteja na parte inferior dos de tecido.
3. Corte o bloco de parafina em fatias de 5 μm de espessura com um micrótomo de parafina. Ajuste o ângulo do bloco de parafina de acordo com a relação proximal, distal, superior e inferior observada ao microscópio para garantir que a polpa da coroa completa e a perfuração do primeiro molar possam ser cortadas.

Resultados

O procedimento descrito acima foi realizado no primeiro molar superior direito de camundongos C57BL/6 de 3, 6-8 semanas de idade, enquanto os primeiros molares superiores esquerdos foram preservados como controle. Os resultados histológicos e de imunofluorescência do controle em branco, amostras de pulpite de 12 h e pulpite de 24 h foram utilizados para demonstração.

Seguindo o protocolo de análise de TC de Goldman et ^al.15, a exposição pulpar foi confirmada por ...

Discussão

Como o único tecido mole dentro dos dentes, a polpa dentária desempenha um papel crucial na manutenção da bioatividade do dente, mas permanece altamente sensível. A preservação dessa polpa vital tornou-se a abordagem inicial preferida em tratamentos endodônticos recentes, necessitando de uma compreensão abrangente dos mecanismos inflamatórios da polpa dentária¹⁶. A flutuação espaço-temporal do microambiente inflamatório e as interações entre os tipos de células residentes na pulp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.