歯髄炎研究のための新規マウスギャグを用いたマウスパルプ曝露モデルの確立

要約

この記事では、革新的なマウスギャグを使用してマウスの歯髄炎モデルを確立するための合理化されたプロトコルと、その後の組織学的分析について説明します。

要約

歯髄炎は、自然な歯の喪失の一般的な原因であり、炎症を起こした歯髄の壊死と生理活性の喪失につながります。歯髄炎の根底にあるメカニズムとその効率的な治療を解明することは、歯内療法研究の継続的な焦点です。したがって、歯髄内の炎症過程を理解することは、歯髄の保存を改善するために不可欠です。他の in vitro 実験と比較して、マウス歯髄炎モデルは、歯髄炎の病理学的進行を観察するための、より本物で遺伝的に多様な状況を提供します。しかし、マウスの使用は、費用対効果が高く、アクセスしやすいにもかかわらず、サイズが小さく、協調性が低く、耐性が低いため困難を伴い、口腔内および歯科治療を複雑にします。このプロトコルは、マウスの髄を露出させるためのマウスギャグの新しい設計と適用を導入し、より効率的な口腔内処置を促進します。マウスギャグは、ほとんどの歯科医がすぐに利用できる歯列弓で構成されており、初めての手術でも手術の準備を大幅に迅速化できます。マイクロCT、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色、および免疫蛍光染色を使用して、形態と細胞発現の変化を特定しました。この記事の目的は、研究者がこの新しい口ギャグを使用して歯髄炎症モデルを作成するための、より再現性が高く、要求の少ない手順を確立するのを支援することです。

概要

歯の不可欠な部分である歯髄は、栄養供給、象牙質形成、感覚機能、防御反応など、複数の重要な機能を担っています¹。それにもかかわらず、硬組織に囲まれた歯髄は、深部虫歯、歯髄炎、外傷、またはその後の治療による損傷や損傷を受けやすい^です2,3。機能的な歯髄がないと、歯の脆弱性のリスクが高まります⁴。さらに、若い永久歯の歯髄の活力の喪失は歯の成熟に悪影響を与える可能性があり、現在の義歯技術は健康な歯髄によって提供される神経フィードバックを回復できません⁴。このような状況により、研究者は、単なる除去だけでなく、炎症を起こした歯髄を管理するための代替ソリューションを模索するようになりました。

2007年、Murrayらは再生歯内療法における組織工学の応用を開始し、それによって歯髄の保存と再生⁵への関心が高まりました。しかし、炎症を起こした歯髄組織は、細胞がIL-6などの炎症性因子を放出し、炎症細胞を動員し、細胞の壊死、歯髄の活力の喪失、および機能回復の合併症を引き起こすため、課題となります^6,7。したがって、炎症とそれに伴う細胞死を理解することは、生命パルプの保存を進歩させるために非常に重要です。in vivoまたはin vitroで炎症果肉の分子生物学を探求するために実施された多くの実験があります^8,9。2Dまたは3D細胞培養のようなin vitro実験は長年にわたって開発され、成熟しつつあり、炎症因子に対する歯髄細胞の反応をテストするために広く使用されつつあるが、これらの実験は歯髄組織と全身免疫系との間の相互作用を反映することはできない¹⁰。研究されている現象が免疫系、血管系、神経系などの他の組織起源の細胞に由来する場合、純粋な歯髄細胞培養は行き詰まりにつながります。したがって、in vivo実験は非常に必要であり、参考になります。

マウスは、その費用対効果、高い生殖能力、および活力により、 in vivoでの炎症研究においてますます一般的な選択肢になっています。ただし、マウスの歯髄炎モデルの包括的なプロトコルは現在存在しておらず、参照として役立ちます。マウスのサイズが小さく、刺激に対する感受性が高いため、実験手順では大きな課題が生じます。マウスの口の奥深くに隠された極小の歯を観察するには、実験室で卓上顕微鏡がより一般的に存在するにもかかわらず、カンチレバー顕微鏡の使用が必要になることがよくあります。開口器がないため、他の人の助けが必要です。これに対処するために、グループは、マウスの歯髄炎モデルを構築するための標準化された再現可能なプロトコルを提供することを目的とした、容易に入手できる材料を使用したマウスギャグを考案しました。この記事では、C57マウスの術前準備、固定化、歯髄曝露手術、およびサンプル採取を含む手順について詳しく説明します。このプロトコルでは、マウスギャグの使用を推奨し、その構造、製造、および適用に関する情報を提供して、他の研究者が手順を再現するのを容易にします。

プロトコル

この研究の実験手順は、四川大学西中国口腔病学院の倫理委員会(WCHSIRB-D-2021-125)によって承認されました。成体C57BL/6マウスは、Gempharmatech Experimental Animals Company(中国・成都)から入手しました。上顎第一大臼歯の冠全体は、生後21日で噴出します。手術を受けるマウスは、生後21日以上で、活力は正常である^{べきである 11}.ここでは、6週齢から8週齢のマウスをモデリングに用いました。 図1 は、使用されるプロトコルを示すフロー図です。

1. 術前準備(図2)

1. 次の器具を入手してください:立体顕微鏡、固定プレート、医療用テープ、口ギャグ、直径0.6mmの低侵襲歯科用バリ、歯科用高速歯科用ハンドピース、8#C +ファイル、加熱パッド、1mLシリンジ、滅菌綿球、目の鉗子。
2. 次の薬を入手してください:麻酔ミックス、獣医軟膏。

2.口ギャグの準備

1. 麻酔ミックス溶液 (10% ケタミン塩酸塩 + 5% キシラジン + 85% 滅菌等張生理食塩水) の腹腔内注射によりマウスの体重を量り、麻酔をかけ、0.007 mL/g 体重でマウスを秤量し、つま先つまみ法で適切な麻酔を確認します。眼科用潤滑軟膏を目に塗布して、手術中の乾燥による眼の損傷を防ぎます。
   注:医療用帽子、マスク、手袋、オーバーオール、その他の基本的な保護具が必要です。手術環境とマウスチャンバーの両方が清潔で安全であることを確認してください。手順全体を通して熱サポートのためのヒートパッドが必要です。
2. 以下に説明するようにマウスギャグを準備します(図3)。
   1. 次の材料を入手してください:直径8μmの歯列矯正アーチワイヤー、ヤングループ曲げプライヤー、ヘビーワイヤーカッター、マーカーペン、長さ3mm、断面直径1mmのゴムキャップ。
   2. まず、固定用の左手でアーチワイヤーをまっすぐにし、親指で右手の人差し指をワイヤーの円弧に対してわずかに曲げます。このアクションを数回繰り返すと、正しい3次元角度への曲げが容易になります。
   3. Yongループベンディングプライヤーを使用して、弓ワイヤーの中点で長さ約3mmの台形(図3C、a-l-k-b)の上端(図3G、a-i)を曲げます。ポイントa(図3)がペンチのくちばしの端にあることを確認してください。
   4. ペンチを左手で持ち、cl 右手の親指と人差し指で弓ワイヤーの自由端を固定し、弓ワイヤーをa点から曲げて約120°の角度にします。ポイント i で前のアクションを繰り返します (図 3G)。アーチワイヤーが1つの平面上にあるかどうか、こじ開けずに水平テーブルに置いて確認します。
   5. 各辺に約9 mmの長さを残し(図3D、a-b、l-k)、各エッジが1つの平面上にあることを確認しながら、手順2.2.4と同じスキルを使用してフリーエンドを75°の角度に曲げます。ペンチのくちばしの先端でこの鋭角を曲げます。
   6. 点bから約5mmの点cを見つけます。同じスキルに従って、ポイントcで105°の角度で曲げます。点 d で 5mm の点でさらに 105° の角度で曲げます。ポイントdから約4.5mm離れて、ポイントeを見つけます。ポイントeで自由端を曲げて、約100〜105°の角度を形成します(図3E)。
      注:使用した6〜8週齢のC57マウスは約20gでした。5mmの間隔は、動かずにマウスの上顎と下顎を詰まらせるだけでなく、マウスの皮膚を圧迫して不快感を引き起こすこともありません。他のマウス種や年齢を使用する場合は、実際の状況に応じてc-dおよびi-h部分の長さを調整してください(図3E、G)。
   7. 下顎部分用の余分な舌圧子を曲げます(図3G、j-i-h-g)。
   8. a-b-cパーツのl-k-jパーツの曲げステップを複製します。i-kパーツとk-jパーツを同時にクランプし、ポイントjで自由端を曲げて、i-k-j平面に対して垂直にします。点 j から 5 mm のところにあるクランプ点 i で、自由端を曲げて i-k-j 平面と c-d 部品の両方に平行にします (図 3H)。
   9. 点iから5mmの長さを残し、点hでアーチをi-h部分に垂直に曲げ、j-i-h平面に平行に曲げます。点hから5mmの地点で点gを見つけます。j-i-h-g平面をクランプし、自由端をk-j部品に対して対称に曲げます。次に、点fの後の自由端は、点e-自由端に対して対称である必要があります(図3H)。
   10. 自由端にゴム製のキャップを取り付けます(図3F)。

3. 固定化

1. マウスの仰臥位を固定プレートに固定し、手足をスキンテープで固定します。口のギャグの自由端を親指と人差し指で圧縮します。
2. マウスの前切歯を2本の腕の台形の溝に固定します。舌圧子付きのアームが下顎骨用であることを確認してください。マウスの舌が固定されているが虚血していないことを確認するために、口のギャグを調整します。

4.歯の評価

1. 手術用の上顎第一大臼歯に虫歯、外傷、歯形成がないことを確認してください。周囲の歯肉に赤み、腫れ、瘻孔がないことを確認してください。反対側の歯が健康で、健康な対照群として行動できることを確認してください。

5. パルプばく露

1. デンタルバリを使用して、上顎第一大臼歯の咬合側を20,000rpmの速度でドリルします。エナメル質が取り除かれていることを確認します。デンタルハンドピースを使用した操作は、歯髄組織¹²への過度の熱刺激を防ぐために、象牙質の浅い層にのみ保管してください。
2. 同時に、手術中は3分ごとに注射器を使用して通常の生理食塩水を歯に落とすことにより、過熱を防ぎます。
3. ドリルで開けたピットの最も低い位置に8#または10#のC +ファイルを置き、最後の象牙質に穴を開けてパルプチャンバーを露出させます。局所的な象牙質を徹底的に取り除くと明らかな転倒感になります。深く探りすぎると、歯髄組織が歯髄チャンバーから持ち出される可能性があります。
4. 歯の周りの破片をきれいにします。口のギャグを外します。手術は終了しました。操作せずに、反対側の上顎第一大臼歯をコントロールとして使用します。

6. 術後のケア

1. 手術後、カルプロフェン(5 mg / kg)を皮下投与し、麻酔から回復するまでマウスを腹臥位で化学温熱加熱パッドに置きます。.マウスに餌を与え、飲料水を提供します。回復プロセスは監視する必要があります。マウスが完全に回復するまで、他の動物を同じチャンバーに置かないでください。

7. サンプルの収集および貯蔵

1. 実験⁹ に従って、手術の 24 時間後またはその他の任意の時点で、深い麻酔条件下で頸部脱臼を起こしたマウスを安楽死させます。上顎と頬骨に付着している骨格筋を眼ハサミで切断します。骨格、前頭骨、軟部組織を切除し、上顎大臼歯で椎弓板を取り出します。
   注:Heらによると、歯髄組織の広範な壊死を避けるために、歯髄炎のサンプルは手術後72時間以内に収集する必要があることが推奨されています¹³。
2. グナトステギトを矢状的に半分に分割し、組織をPBS、pH 7.4、4°Cの4%パラホルムアルデヒドに24時間固定します。

8. 組織学的解析

1. 組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、5%EDTAおよびPBSの4%スクロースの日替わり脱灰溶液、pH 7.4で4°Cで2〜4週間脱灰します¹⁰。
2. 1/2 gnathostegite をパラフィンに埋め込み、歯のない矢状面が組織カセットの底にあることを確認します。
3. パラフィンブロックをパラフィンミクロトームで5 μmの厚さにスライスします。顕微鏡で観察される近位、遠位、上部、下部の関係に応じてパラフィンブロックの角度を調整し、完全なクラウンパルプと第一大臼歯の穿孔を切断できるようにします。

結果

上記の手順は、3、6〜8週齢のC57BL / 6マウスの右上顎第一大臼歯で行われましたが、左上顎第一大臼歯はコントロールとして保存されました。ブランクコントロール、12時間歯髄炎および24時間歯髄炎サンプルからの組織学および免疫蛍光結果をデモンストレーションに利用しました。

Goldman et ^al.15 の CT 解析のプロトコルに従って、図 4

ディスカッション

歯髄は、歯の中の孤立した軟組織として、歯の生理活性を維持する上で重要な役割を果たしていますが、依然として非常に敏感です。この重要な歯髄の保存は、最近の歯内療法において好ましい初期アプローチとなっており、歯髄の炎症メカニズムを包括的に理解する必要があります¹⁶。炎症性微小環境の時空間変動と歯髄炎の常在細胞型間の相互作用は、 in vitro 研?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.