Istituzione di un modello di esposizione alla polpa murina con un nuovo bavaglio orale per la ricerca sulla pulpite

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo semplificato per stabilire un modello di pulpite nei topi utilizzando un innovativo bavaglio orale, seguito da una successiva analisi istologica.

Abstract

La pulpite, una causa comune di perdita naturale dei denti, porta alla necrosi e alla perdita di bioattività nella polpa dentale infiammata. Svelare i meccanismi alla base della pulpite e il suo trattamento efficace è un obiettivo costante della ricerca endodontica. Pertanto, comprendere il processo infiammatorio all'interno della polpa dentale è fondamentale per migliorare la conservazione della polpa. Rispetto ad altri esperimenti in vitro , un modello di pulpite murina offre un contesto più autentico e geneticamente diversificato per osservare la progressione patologica della pulpite. Tuttavia, l'uso dei topi, nonostante la loro economicità e accessibilità, pone difficoltà a causa delle loro piccole dimensioni, scarsa coordinazione e bassa tolleranza, complicando le procedure intraorali e dentistiche. Questo protocollo introduce un nuovo design e l'applicazione di un bavaglio per esporre la polpa di topo, facilitando procedure intraorali più efficienti. Il bavaglio, composto da un'arcata dentale prontamente disponibile per la maggior parte dei dentisti, può accelerare notevolmente la preparazione chirurgica, anche per le prime procedure. La micro-CT, la colorazione con ematossilina-eosina (HE) e la colorazione in immunofluorescenza sono state utilizzate per identificare i cambiamenti nella morfologia e nell'espressione cellulare. Lo scopo di questo articolo è quello di aiutare i ricercatori a stabilire una procedura più riproducibile e meno impegnativa per la creazione di un modello di infiammazione della polpa utilizzando questo nuovo bavaglio.

Introduzione

La polpa dentale, parte integrante del dente, è responsabile di molteplici funzioni essenziali come l'apporto di nutrienti, la formazione della dentina, la funzione sensoriale e le reazioni di difesa¹. Tuttavia, la polpa dentale, circondata da tessuto duro, è suscettibile di lesioni e danni da carie profonde, pulpiti, traumi o terapie successive ^2,3. L'assenza di polpa dentale funzionale aumenta il rischio di fragilità dei denti⁴. Inoltre, la perdita di vitalità della polpa nei denti permanenti giovani può influire negativamente sulla maturazione dei denti e le attuali tecniche di protesi non riescono a ripristinare il feedback neurale offerto dalla polpa sana⁴. Questa situazione ha portato i ricercatori a esplorare soluzioni alternative per la gestione della polpa infiammata oltre la semplice rimozione.

Nel 2007, Murray et al. hanno avviato l'applicazione dell'ingegneria tissutale nell'endodonzia rigenerativa, suscitando così un crescente interesse per la conservazione e la rigenerazione della polpa⁵. Tuttavia, il tessuto pulpare infiammato rappresenta una sfida poiché le cellule rilasciano fattori infiammatori come l'IL-6, che reclutano le cellule infiammatorie e provocano necrosi cellulare, perdita di vitalità della polpa e complicazioni nel recupero funzionale ^6,7. Comprendere l'infiammazione e la morte cellulare associata è, quindi, fondamentale per i progressi nella conservazione della polpa vitale. Ci sono una serie di esperimenti che sono stati condotti per esplorare la biologia molecolare della polpa infiammata in vivo o in vitro ^8,9. Sebbene gli esperimenti in vitro come le colture cellulari 2D o 3D siano stati sviluppati per anni e stiano diventando maturi e ampiamente utilizzati per testare le reazioni delle cellule pulpari ai fattori infiammatori, questi esperimenti non possono riflettere l'interazione tra il tessuto pulpare e il sistema immunitario sistemico¹⁰. Se il fenomeno studiato deriva da cellule di altra origine tissutale come il sistema immunitario, vascolare e nervoso, allora la coltura di cellule di polpa pura porterà a un vicolo cieco. Pertanto, gli esperimenti in vivo sono molto necessari e referenziali.

I topi sono diventati sempre più una scelta comune nella ricerca sull'infiammazione in vivo grazie al loro rapporto costo-efficacia, all'elevata fertilità e alla vitalità. Tuttavia, attualmente manca un protocollo completo per il modello di pulpite dei topi, che possa fungere da riferimento. Le piccole dimensioni dei topi e la loro sensibilità alla stimolazione pongono sfide significative durante le procedure sperimentali. L'osservazione dei minuscoli denti nascosti in profondità all'interno della bocca del topo richiede spesso l'uso di un microscopio a sbalzo, nonostante la presenza più comune di microscopi da tavolo nei laboratori. L'assenza di un apribocca richiede l'assistenza di altri. Per affrontare questo problema, il gruppo ha ideato un bavaglio orale utilizzando materiali prontamente disponibili che mira a fornire un protocollo standardizzato e riproducibile per la costruzione del modello di pulpite dei topi. Questo articolo descrive in dettaglio la procedura, coprendo la preparazione preoperatoria, l'immobilizzazione, la chirurgia dell'esposizione della polpa e la raccolta di campioni su topi C57. Questo protocollo raccomanda l'uso del bavaglio, fornendo informazioni sulla sua struttura, produzione e applicazione per facilitare altri ricercatori nella replica della procedura.

Protocollo

Le procedure sperimentali in questo studio sono state approvate dal comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-125). I topi adulti C57BL/6 sono stati ottenuti dalla Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, Cina. L'intera corona del primo molare mascellare erutta 21 giorni dopo la nascita. I topi per l'intervento chirurgico dovrebbero avere più di 21 giorni con una vitalità normale¹¹. Qui, per la modellazione venivano utilizzati topi di età compresa tra 6 e 8 settimane. La Figura 1 è un diagramma di flusso che mostra il protocollo utilizzato.

1. Preparazione preoperatoria (Figura 2)

1. Procurarsi i seguenti strumenti: microscopio stereoscopico, piastra di fissaggio, nastro medicale, bavaglio orale, fresa dentale minimamente invasiva con un diametro di 0,6 mm, manipolo dentale ad alta velocità, lima 8# C+, termoforo, siringa da 1 ml, batuffolo di cotone sterile, pinza oculare.
2. Ottenere i seguenti farmaci: miscela per anestesia, unguento veterinario.

2. Preparazione del bavaglio

1. Pesare e anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di miscela per anestesia (10% ketamina cloridrato + 5% xilazina + 85% soluzione salina isotonica sterile) a 0,007 ml/g di peso corporeo e confermare la corretta anestesia attraverso il metodo del pizzicamento delle dita. Applicare un unguento lubrificante oftalmico sugli occhi per evitare lesioni agli occhi dovute all'essiccazione durante il funzionamento.
   NOTA: Sono necessari cappelli medici, maschere, guanti e tute e altre protezioni di base. Assicurati che sia l'ambiente chirurgico che la camera del mouse siano puliti e sicuri. È necessario un cuscinetto termico per il supporto termico durante tutta la procedura.
2. Preparare il bavaglio come descritto di seguito (Figura 3).
   1. Procurarsi i seguenti materiali: filo ortodontico per arco con diametro di 8 μm, pinza per piegare ad anello giovane, tronchese pesante, pennarello, cappuccio in gomma con una lunghezza di 3 mm e un diametro della sezione trasversale di 1 mm.
   2. Per prima cosa, raddrizza il filo dell'arco con la mano sinistra per il fissaggio e il pollice, l'indice della mano destra si piega leggermente contro l'arco del filo. Ripeti questa azione più volte, faciliterà la flessione al corretto angolo tridimensionale.
   3. Utilizzare la pinza piegatrice ad anello Yong per piegare il bordo superiore (Figura 3G, a-i) del trapezio (Figura 3C, a-l-k-b) lungo circa 8 mm nel punto medio del filo dell'arco. Assicurarsi che il punto a (Figura 3) si trovi sul bordo del becco della pinza.
   4. Tenere le pinze con la mano sinistra, bloccare l'estremità libera del filo dell'arco con il pollice e l'indice destro e piegare il filo dell'arco dal punto a per formare un angolo di circa 120°. Duplicare l'azione precedente nel punto i (Figura 3G). Controlla se il filo dell'arco è su un piano mettendolo su un tavolo orizzontale senza fare leva.
   5. Lasciare circa 9 mm di lunghezza su ciascun lato (Figura 3D, a-b, l-k) e piegare l'estremità libera a un angolo di 75° utilizzando la stessa abilità del passaggio 2.2.4, assicurandosi che ogni bordo sia su un piano. Piega questo angolo acuto con la punta del becco della pinza.
   6. Trova il punto c a circa 5 mm dal punto b. Segui la stessa abilità per piegare un angolo di 105° sul punto c. Piegare un altro angolo di 105° al punto d a 5 mm dal punto c. Lasciare circa 4,5 mm dal punto d e trovare il punto e. Piegare l'estremità libera nel punto e per formare un angolo di circa 100 -105° (Figura 3E).
      NOTA: I topi C57 di 6-8 settimane che abbiamo usato erano di circa 20 g. La spaziatura di 5 mm non solo poteva inceppare le mascelle superiore e inferiore dei topi senza muoversi, ma non premeva nemmeno la pelle dei topi e causava disagio. Se vengono utilizzate altre specie o età di topi, regolare la lunghezza delle parti cd e ih in base alla situazione reale (Figura 3E, G).
   7. Piegare un abbassalingua in più per la parte mandibolare (Figura 3G, j-i-h-g).
   8. Duplicare i passaggi di piegatura della parte a-b-c sulla parte l-k-j. Bloccare contemporaneamente le parti i-k e k-j e piegare l'estremità libera nel punto j per renderla verticale rispetto al piano i-k-j. Clamp il punto i che si trova a 5 mm dal punto j, piegare l'estremità libera per renderla parallela sia al piano i-k-j che alla parte c-d (Figura 3H).
   9. Lasciare 5 mm di lunghezza dal punto i, al punto h, piegare l'arco verticalmente alla parte i-h e parallelamente al piano j-i-h. Trova il punto g a 5 mm dal punto h. Bloccare il piano j-i-h-g e piegare l'estremità libera simmetricamente alla parte k-j. Quindi l'estremità libera dopo il punto f dovrebbe essere simmetrica al punto e-estremità libera (Figura 3H).
   10. Mettere i cappucci di gomma sull'estremità libera (Figura 3F).

3. Immobilizzazione

1. Fissare il mouse supino sulla piastra di fissaggio con gli arti fissati con nastro adesivo. Comprimere le estremità libere del bavaglio con il pollice e l'indice.
2. Fissare gli incisivi anteriori del mouse nella scanalatura trapezoidale di due bracci. Assicurarsi che il braccio con abbassalingua sia per la mandibola. Regola il bavaglio per assicurarti che la lingua del topo sia immobilizzata ma non ischemica.

4. Valutazione dei denti

1. Assicurarsi che il primo molare mascellare per l'intervento chirurgico sia privo di carie dentali, traumi e odontogenesi. Assicurarsi che non vi siano arrossamenti, gonfiori o fistole sulla gengiva circostante. Assicurati che i denti opposti siano sani e disponibili ad agire come gruppo di controllo sano.

5. Esposizione alla polpa

1. Utilizzare la fresa dentale per perforare il lato occlusale del primo molare mascellare a una velocità di 20.000 giri/min. Assicurarsi che lo smalto sia stato rimosso. Mantenere l'operazione con il manipolo dentale solo in uno strato superficiale di dentina per evitare un'eccessiva stimolazione termica sul tessuto pulpare dentale¹².
2. Allo stesso tempo, prevenire il surriscaldamento utilizzando una siringa per far cadere la soluzione fisiologica normale sul dente ogni 3 minuti durante l'operazione.
3. Mettere una lima C+ 8# o 10# nella posizione più bassa della fossa perforata e perforare l'ultima dentina per esporre la camera pulpare. Sarà un'evidente sensazione di caduta quando la dentina locale sarà completamente rimossa. Non pompare troppo in profondità, altrimenti il tessuto pulpare dentale potrebbe essere portato fuori dalla camera pulpare.
4. Pulisci i frammenti intorno al dente. Togliete il bavaglio; L'intervento è terminato. Utilizzare il primo molare mascellare opposto come controllo senza operazione.

6. Assistenza post-operatoria

1. Dopo l'intervento chirurgico, somministrare carprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea e posizionare il mouse sul termoforo chemiotermico in posizione prona fino al recupero dall'anestesia. Dai da mangiare ai topi e fornisci acqua potabile. Il processo di recupero deve essere supervisionato. Nessun altro animale dovrebbe trovarsi nella stessa camera fino a quando il topo non si sarà completamente ripreso.

7. Raccolta e conservazione dei campioni

1. Eutanasia del topo con lussazione cervicale in condizioni di anestesia profonda 24 ore dopo l'operazione o in qualsiasi altro momento come da esperimento⁹. Tagliare i muscoli dello scheletro attaccati alla mascella e allo zigoma con le forbici oftalmiche. Rimuovere lo scheletro, l'osso frontale e i tessuti molli ed estrarre la lamina gnatostegite con i molari mascellari.
   NOTA: Secondo He et al., si raccomanda che il campione di pulpite debba essere raccolto meno di 72 ore dopo l'intervento chirurgico per evitare un'estesa necrosi nel tessuto pulpare dentale¹³.
2. Dividere agittalmente la gnatostegite a metà e conservare il tessuto in paraformaldeide al 4% in PBS, pH 7,4, a 4 °C per fissazione 24h.

8. Analisi istologica

1. Lavare il tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e decalcificarlo in una soluzione decalcificante cambiata giornalmente al 5% di EDTA e 4% di saccarosio in PBS, pH 7,4, a 4 °C per 2-4 settimane¹⁰.
2. Incorporare 1/2 gnathostegite nella paraffina e assicurarsi che la faccia sagittale senza denti sia sul fondo delle cassette di tessuto.
3. Tagliare il blocco di paraffina a fette spesse 5 μm con un microtomo di paraffina. Regolare l'angolo del blocco di paraffina in base alla relazione prossimale, distale, superiore e inferiore osservata al microscopio per garantire che la polpa della corona completa e la perforazione del primo molare possano essere tagliate.

Risultati

La procedura sopra descritta è stata eseguita sul primo molare mascellare destro di topi C57BL/6 di 3, 6-8 settimane, mentre i primi molari mascellari sinistri sono stati conservati come controllo. Per la dimostrazione sono stati utilizzati i risultati istologici e di immunofluorescenza del controllo in bianco, campioni di pulpite di 12 ore e pulpite di 24 ore.

Seguendo il protocollo di analisi TC di Goldman et ^al.15, l'esposizione alla polpa è stata confermata attrav...

Discussione

Essendo il tessuto molle solitario all'interno dei denti, la polpa dentale svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della bioattività del dente, ma rimane altamente sensibile. La conservazione di questa polpa vitale è diventata l'approccio iniziale preferito nei recenti trattamenti endodontici, richiedendo una comprensione completa dei meccanismi infiammatori della polpa dentale¹⁶. La fluttuazione spazio-temporale del microambiente infiammatorio e le interazioni tra i tipi di cellule residenti ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.