Pulpitis Araştırmaları için Yeni Bir Ağız Tıkaç ile Murin Pulpa Maruziyet Modelinin Kurulması

Özet

Bu makale, yenilikçi bir ağız tıkaç kullanarak farelerde bir pulpitis modeli oluşturmak için kolaylaştırılmış bir protokol ve ardından müteakip histolojik analiz sunmaktadır.

Özet

Doğal diş kaybının yaygın bir nedeni olan pulpitis, iltihaplı diş pulpasında nekroza ve biyoaktivite kaybına yol açar. Pulpitisin altında yatan mekanizmaların çözülmesi ve etkili tedavisi, endodontik araştırmaların devam eden bir odak noktasıdır. Bu nedenle, diş pulpasındaki enflamatuar süreci anlamak, pulpanın korunmasını iyileştirmek için hayati önem taşır. Diğer in vitro deneylerle karşılaştırıldığında, bir murin pulpitis modeli, pulpitisin patolojik ilerlemesini gözlemlemek için daha otantik ve genetik olarak çeşitli bir bağlam sunar. Bununla birlikte, maliyet etkinliği ve erişilebilirliğine rağmen farelerin kullanılması, küçük boyutları, zayıf koordinasyonları ve düşük toleransları nedeniyle ağız içi ve diş prosedürlerini karmaşıklaştıran zorluklar doğurmaktadır. Bu protokol, fare pulpasını ortaya çıkarmak için yeni bir ağız tıkaç tasarımı ve uygulaması sunarak daha verimli ağız içi prosedürleri kolaylaştırır. Ağız tıkacı, çoğu diş hekimi tarafından kolayca bulunabilen bir diş kemerinden oluşur ve ilk kez yapılan prosedürler için bile cerrahi hazırlığı önemli ölçüde hızlandırabilir. Morfoloji ve hücre ekspresyonundaki değişiklikleri tanımlamak için mikro-BT, hematoksilen-eozin (HE) boyaması ve immünofloresan boyama kullanıldı. Bu makalenin amacı, araştırmacıların bu yeni ağız tıkaç kullanarak bir pulpa iltihabı modeli oluşturmak için daha tekrarlanabilir ve daha az talepkar bir prosedür oluşturmalarına yardımcı olmaktır.

Giriş

Dişin ayrılmaz bir parçası olan diş pulpası, besin temini, dentin oluşumu, duyusal fonksiyon ve savunma reaksiyonları gibi birçok temel fonksiyondan sorumludur¹. Bununla birlikte, sert doku ile çevrili diş pulpası, derin çürükler, pulpitis, travma veya sonraki tedavilerden kaynaklanan yaralanmalara ve hasarlara karşı hassastır ^2,3. Fonksiyonel diş pulpasının olmaması diş kırılganlığı riskini artırır⁴. Ayrıca, genç kalıcı dişlerde pulpa canlılığının kaybı diş olgunlaşmasını olumsuz etkileyebilir ve mevcut protez teknikleri, sağlıklı pulpanın sunduğu nöral geri bildirimi geri kazandırmakta başarısız olur⁴. Bu durum, araştırmacıları iltihaplı posayı sadece çıkarmanın ötesinde yönetmek için alternatif çözümler keşfetmeye yöneltti.

2007 yılında Murray ve ark. rejeneratif endodontide doku mühendisliği uygulamasını başlatmış ve böylece pulpanın korunması ve rejenerasyonuna olan ilginin artmasına neden olmuştur⁵. Bununla birlikte, iltihaplı pulpa dokusu, hücrelerin enflamatuar hücreleri işe alan ve hücre nekrozu, pulpa canlılığının kaybı ve fonksiyonel iyileşmede komplikasyonlarla sonuçlanan IL-6 gibi enflamatuar faktörleri serbest bırakması nedeniyle bir zorluk teşkil eder ^6,7. Bu nedenle, iltihabı ve buna bağlı hücre ölümünü anlamak, hayati pulpanın korunmasındaki ilerlemeler için çok önemlidir. İnflamasyon pulpasının moleküler biyolojisini in vivo veya in vitro^olarak araştırmak için yapılmış bir dizi deney vardır ^8,9. Her ne kadar 2D veya 3D hücre kültürleri gibi in vitro deneyler yıllardır geliştirilmiş ve olgunlaşmakta ve pulpa hücrelerinin enflamatuar faktörlere reaksiyonlarını test etmek için yaygın olarak kullanılsa da, bu deneyler pulpa dokusu ile sistemik bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimi yansıtamamaktadır¹⁰. İncelenen fenomen, bağışıklık, vasküler ve sinir sistemi gibi diğer doku kökenli hücrelerden türetilirse, saf pulpa hücre kültürü bir çıkmaza yol açacaktır. Bu nedenle, in vivo deneyler çok gerekli ve referanslıdır.

Fareler, maliyet etkinlikleri, yüksek doğurganlıkları ve canlılıkları nedeniyle in vivo inflamasyon araştırmalarında giderek daha yaygın bir seçim haline gelmiştir. Bununla birlikte, fareler pulpitis modeli için kapsamlı bir protokol şu anda mevcut değildir ve bu bir referans olarak hizmet edebilir. Farelerin küçük boyutları ve stimülasyona karşı duyarlılıkları, deneysel prosedürler sırasında önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Fare ağzının derinliklerine gizlenmiş küçük dişleri gözlemlemek, laboratuvarlarda masaüstü mikroskopların daha yaygın olmasına rağmen, genellikle bir konsol mikroskobunun kullanılmasını gerektirir. Ağız açıcının olmaması başkalarının yardımını gerektirir. Bunu ele almak için grup, fare pulpitis modelini oluşturmak için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokol sağlamayı amaçlayan, hazır malzemeleri kullanarak bir ağız tıkaç tasarladı. Bu makale, C57 farelerinde preoperatif hazırlık, immobilizasyon, pulpa maruziyet cerrahisi ve numune toplamayı kapsayan prosedürü detaylandırmaktadır. Bu protokol, diğer araştırmacıların prosedürü tekrarlamasını kolaylaştırmak için yapısı, üretimi ve uygulaması hakkında bilgi sağlayarak ağız tıkaçının kullanılmasını önerir.

Protokol

Bu çalışmadaki deneysel prosedürler, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Stomatoloji Okulu etik komitesi tarafından onaylanmıştır (WCHSIRB-D-2021-125). Yetişkin C57BL / 6 fareleri, Gempharmatech Deney Hayvanları Şirketi, Chengdu, Çin'den elde edildi. Maksiller birinci azı dişinin tüm tacı doğumdan 21 gün sonra patlar. Ameliyat için fareler normal canlılık ile 21 günden daha eski olmalıdır¹¹. Burada, modelleme için 6 ila 8 haftalık fareler kullanıldı. Şekil 1 , kullanılan protokolü gösteren bir akış diyagramıdır.

1. Ameliyat öncesi hazırlık (Şekil 2)

1. Aşağıdaki aletleri edinin: Stereoskopik mikroskop, sabitleme plakası, tıbbi bant, ağız tıkacı, 0,6 mm çapında minimal invaziv diş çapağı, dental yüksek hızlı diş el aleti, 8 # C + dosyası, ısıtma yastığı, 1 mL şırınga, steril pamuk topu, göz forseps.
2. Aşağıdaki ilaçları edinin: anestezi karışımı, veteriner merhemi.

2. Ağız tıkacının hazırlanması

1. Fareyi 0.007 mL / g vücut ağırlığında anestezi karışımı çözeltisinin (% 10 ketamin hidroklorür +% 5 ksilazin +% 85 steril izotonik salin) intraperitoneal enjeksiyonu ile tartın ve uyuşturun ve ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle uygun anesteziyi onaylayın. Çalışma sırasında kurumaya bağlı olarak gözlerin yaralanmasını önlemek için gözlere oftalmik kayganlaştırıcı merhem sürün.
   NOT: Tıbbi şapkalar, maskeler, eldivenler ve tulumlar ve diğer temel koruma gereklidir. Hem ameliyat ortamının hem de fare odasının temiz ve güvenli olduğundan emin olun. Prosedür boyunca termal destek için bir ısı yastığı gereklidir.
2. Ağız tıkacını aşağıda açıklandığı gibi hazırlayın (Şekil 3).
   1. Aşağıdaki malzemeleri edinin: 8 μm çapında ortodontik ark teli, genç halka bükme pensesi, ağır tel kesici, işaretleyici kalem, 3 mm uzunluğunda ve 1 mm kesit çapında lastik kapak.
   2. İlk olarak, sabitleme için ark telini sol elinizle düzeltin ve başparmağınızı düzeltin, sağ elin işaret parmağı telin yayına doğru hafifçe bükün. Bu işlemi birkaç kez tekrarlayın, doğru üç boyutlu Açıya bükülmeyi kolaylaştıracaktır.
   3. Yay telinin orta noktasında yaklaşık 8 mm uzunluğundaki yamuğun (Şekil 3C, a-lk-b) üst kenarını (Şekil 3G, a-i) bükmek için Yong halka bükme pensesini kullanın. A noktasının (Şekil 3) pense gagasının kenarında olduğundan emin olun.
   4. Penseyi sol elinizle tutun, yay telinin serbest ucunu sağ başparmağınız ve işaret parmağınızla sıkıştırın ve yaklaşık 120°'lik bir açı yapmak için yay telini a noktasından bükün. i noktasındaki önceki eylemi çoğaltın (Şekil 3G). Ark telinin meraklı olmadan yatay bir masaya koyarak bir düzlemde olup olmadığını kontrol edin.
   5. Her iki tarafta yaklaşık 9 mm uzunluk bırakın (Şekil 3D, a-b, l-k) ve her bir kenarın bir düzlem üzerinde olduğundan emin olurken, adım 2.2.4 ile aynı beceriyi kullanarak serbest ucu 75°'lik bir açıyla bükün. Bu keskin açıyı pense gagasının ucuyla bükün.
   6. b noktasından yaklaşık 5 mm uzaklıktaki c noktasını bulun. C noktasında 105°'lik bir açı bükmek için aynı beceriyi izleyin. c noktasından 105 mm d noktasında 5° açı daha bükün. D noktasından yaklaşık 4,5 mm bırakın ve e noktasını bulun. Yaklaşık 100 -105°'lik bir açı oluşturmak için serbest ucu e noktasında bükün (Şekil 3E).
      NOT: Kullandığımız 6-8 haftalık C57 fareleri yaklaşık 20 g idi. 5 mm'lik aralık sadece farelerin üst ve alt çenelerini hareket etmeden sıkıştırmakla kalmaz, aynı zamanda farelerin cildine baskı yapmaz ve rahatsızlığa neden olmaz. Başka türler veya yaşlardaki fareler kullanılıyorsa, lütfen cd ve ih parçalarının uzunluğunu fiili duruma göre ayarlayın (Şekil 3E,G).
   7. Mandibular kısım için fazladan bir dil bastırıcı bükün (Şekil 3G, j-i-h-g).
   8. a-b-c parçasının l-k-j parçasındaki çift büküm adımları. I-k ve kj parçalarını aynı anda sıkıştırın ve serbest ucu j noktasında bükün ve i-k-j düzlemine dikey hale getirin. J noktasından 5 mm uzakta olan kenetlenme noktası i, serbest ucu hem i-k-j düzlemine hem de c-d kısmına paralel olacak şekilde bükün (Şekil 3H).
   9. İ noktasından 5 mm uzunluk bırakın, h noktasında kemeri i-h kısmına dikey ve j-i-h düzlemine paralel olarak bükün. H noktasından 5 mm'de g noktasını bulun. JIHG düzlemini sıkıştırın ve serbest ucu kj kısmına simetrik olarak bükün. Daha sonra f noktasından sonraki serbest uç, e-serbest uç noktasına simetrik olmalıdır (Şekil 3H).
   10. Serbest uca lastik kapaklar yerleştirin (Şekil 3F).

3. İmmobilizasyon

1. Fareyi sırt üstüne, deri bandı ile sabitlenmiş uzuvlarla sabitleme plakasına sabitleyin. Ağız tıkacının serbest uçlarını başparmak ve işaret parmağınızla sıkıştırın.
2. Farenin ön kesici dişlerini iki kolun yamuk oluğuna sabitleyin. Dil bastırıcılı kolun mandibula için olduğundan emin olun. Farenin dilinin hareketsiz olduğundan ancak iskemik olmadığından emin olmak için ağız tıkacını ayarlayın.

4. Diş değerlendirmesi

1. Ameliyat için maksiller birinci azı dişinin diş çürüğü, travma ve odontogenez içermediğinden emin olun. Çevredeki diş etinde kızarıklık, şişlik veya fistül olmadığından emin olun. Karşı dişlerin sağlıklı olduğundan ve sağlıklı kontrol grubu olarak hareket etmeye hazır olduğundan emin olun.

5. Kağıt hamuru maruziyeti

1. Maksiller birinci azı dişinin oklüzal tarafında 20.000 rpm hızında delmek için diş çapağı kullanın. Emayenin çıkarıldığından emin olun. Diş pulpa dokusu üzerinde aşırı termal stimülasyonu önlemek için dental el aleti ile işlemi sadece sığ dentin tabakasında tutun¹².
2. Aynı zamanda, operasyon sırasında her 3 dakikada bir diş üzerine normal salin damlatmak için bir şırınga kullanarak aşırı ısınmayı önleyin.
3. Delinmiş çukurun en alt konumuna 8 # veya 10 # C + eğesi koyun ve pulpa odasını ortaya çıkarmak için son dentini delin. Lokal dentin tamamen çıkarıldığında belirgin bir düşme hissi olacaktır. Çok derine inmeyin, aksi takdirde diş pulpa dokusu pulpa odasından dışarı çıkarılabilir.
4. Dişin etrafındaki parçaları temizleyin. Ağız tıkacını çıkarın; Ameliyat bitti. Karşı maksiller birinci azı dişini işlem yapmadan kontrol olarak kullanın.

6. Ameliyat sonrası bakım

1. Ameliyattan sonra, carprofen'i (5 mg / kg) deri altına uygulayın ve fareyi anesteziden iyileşene kadar yüzüstü pozisyonda kemotermal ısıtma yastığının üzerine yerleştirin. Fareleri besleyin ve içme suyu sağlayın. Kurtarma süreci denetlenmelidir. Fare tamamen iyileşene kadar aynı odada başka hiçbir hayvan bulunmamalıdır.

7. Numune toplama ve saklama

1. Deney^9'a göre, operasyondan 24 saat sonra veya başka bir zaman noktasında derin anestezik koşul altında servikal çıkık olan fareyi ötenazi yapın. Maksilla ve zigomaya bağlı iskelet kaslarını oftalmik makasla kesin. İskeleti, ön kemiği ve yumuşak dokuyu çıkarın ve maksiller azı dişleri ile lamina gnathostegite'yi çıkarın.
   NOT: He ve arkadaşlarına göre, diş pulpası dokusunda geniş nekrozu önlemek için pulpitis örneğinin ameliyattan 72 saatten daha kısa bir süre sonra toplanması gerektiği takdir edilmektedir¹³.
2. Gnathostegite'i sagittal olarak ikiye bölün ve dokuyu 24 saat fiksasyon için 4 ° C'de PBS, pH 7.4'te% 4 paraformaldehit içinde saklayın.

8. Histolojik analiz

1. Dokuyu fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve PBS, pH 7.4'te pH 7.4'te 2-4 hafta boyunca 4 ° C'de% 5 EDTA ve% 4 sükrozdan oluşan günlük değiştirilmiş dekalsifikasyon solüsyonunda kireçten arındırın¹⁰.
2. 1/2 gnathostegite'yi parafine gömün ve dişsiz sagital yüzün doku kasetlerinin dibinde olduğundan emin olun.
3. Parafin bloğunu bir parafin mikrotomu ile 5 μm kalınlığında dilimler halinde kesin. Parafin bloğunun açısını, mikroskop altında gözlemlenen proksimal, distal, üst ve alt ilişkiye göre ayarlayın, böylece tam taç hamurunun ve birinci azı dişinin perforasyonunun kesilebilmesini sağlayın.

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen işlem 3, 6-8 haftalık C57BL/6 farelerin sağ maksiller birinci azı dişlerine uygulanırken, sol maksiller birinci azı dişleri kontrol olarak korundu. Boş kontrolden elde edilen histoloji ve immünofloresan sonuçları, 12 saat pulpitis ve 24 saat pulpitis örnekleri gösterim için kullanıldı.

Goldman ve ^ark.15'ten alınan BT analizi protokolünü takiben, pulpa maruziyeti Şekil 4 A-C'de mik...

Tartışmalar

Dişlerin içindeki tek yumuşak doku olan diş pulpası, dişin biyoaktivitesinin korunmasında çok önemli bir rol oynar, ancak oldukça hassas kalır. Bu hayati pulpanın korunması, son endodontik tedavilerde tercih edilen ilk yaklaşım haline gelmiştir ve dental pulpanın enflamatuar mekanizmalarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını gerektirmiştir¹⁶. İnflamatuar mikroçevrenin uzay-zamansal dalgalanması ve pulpitiste yerleşik hücre tipleri arasındaki etkileşimler, in v...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.