הקמת מודל חשיפה למועיסת מוך עם פיו חדשני לחקר דלקת הדוכן

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול יעיל לביסוס מודל דלקת מוך בעכברים באמצעות גאג פה חדשני, ואחריו ניתוח היסטולוגי עוקב.

Abstract

דלקת מוך השן, סיבה נפוצה לאובדן שיניים טבעי, מובילה לנמק ולאובדן פעילות ביולוגית במוך השן המודלק. חשיפת המנגנונים העומדים בבסיס דלקת המוך והטיפול היעיל בה היא מוקד מתמשך של מחקר אנדודונטי. לכן, הבנת התהליך הדלקתי במוך השן חיונית לשיפור שימור מוך השן. בהשוואה לניסויים אחרים במבחנה , מודל Murine pulpitis מציע הקשר אותנטי יותר ומגוון גנטית כדי לבחון את ההתקדמות הפתולוגית של דלקת המוך. עם זאת, השימוש בעכברים, למרות עלות-תועלתם ונגישותם, מציב קשיים בשל גודלם הקטן, קואורדינציה לקויה וסבילות נמוכה, המסבכים הליכים תוך-אוראליים וטיפולי שיניים. פרוטוקול זה מציג עיצוב חדשני ויישום של פי-גאג כדי לחשוף את עיסת העכבר, מה שמקל על הליכים אינטרה-אוראליים יעילים יותר. סתימת הפה, המורכבת מקשת דנטלית זמינה לרוב רופאי השיניים ויכולה לזרז משמעותית את ההכנה לניתוח, אפילו להליכים ראשונים. מיקרו-CT, צביעת המטוקסילין-אאוסין (HE) וצביעה אימונופלואורסצנטית שימשו לזיהוי שינויים במורפולוגיה ובביטוי תאים. מטרת מאמר זה היא לסייע לחוקרים לבסס הליך ניתן לשחזור יותר ותובעני פחות ליצירת מודל דלקת במוך השן באמצעות סתימת הפה החדשנית הזו.

Introduction

מוך השן, חלק בלתי נפרד מהשן, אחראי על תפקודים חיוניים רבים כגון אספקת חומרים מזינים, היווצרות דנטין, תפקוד תחושתי ותגובות הגנה¹. עם זאת, מוך השן, מוקף רקמה קשה, רגיש לפציעות ונזקים מעששת עמוקה, דלקת מוך השן, טראומה, או טיפולים הבאים ^2,3. היעדר מוך שיניים פונקציונלי מגביר את הסיכון לשבריריות השן⁴. יתר על כן, אובדן חיוניות מוך השן בשיניים קבועות צעירות יכול להשפיע לרעה על הבשלת השן, וטכניקות התותבות הנוכחיות אינן מצליחות לשחזר את המשוב העצבי המוצע על ידי מוך⁴ בריא. מצב זה הוביל חוקרים לבחון פתרונות חלופיים לטיפול במוך השן המודלק מעבר להסרה.

בשנת 2007, מוריי ועמיתיו יזמו את היישום של הנדסת רקמות באנדודונטיה רגנרטיבית, ובכך עוררו עניין מוגבר בשימור מוך השן והתחדשות⁵. עם זאת, רקמת מוך מוך דלקתית מהווה אתגר מכיוון שתאים משחררים גורמים דלקתיים כגון IL-6, המגייסים תאים דלקתיים וגורמים לנמק תאים, אובדן חיוניות מוך השן וסיבוכים בהתאוששות תפקודית ^6,7. הבנת הדלקת ומוות התאים הנלווה אליה, אם כן, חיונית להתקדמות בשימור מוך השן החיוני. ישנם מספר ניסויים שנערכו כדי לחקור את הביולוגיה המולקולרית של עיסת דלקת in vivo או in vitro ^8,9. למרות שניסויים במבחנה כמו תרביות תאים דו-ממדיות או תלת-ממדיות פותחו במשך שנים והם הופכים לבוגרים ונמצאים בשימוש נרחב לבדיקת תגובות של תאי מוך השן לגורמים דלקתיים, ניסויים אלה אינם יכולים לשקף את האינטראקציה בין רקמת מוך השן לבין מערכת החיסון המערכתית¹⁰. אם התופעה הנחקרת נגזרת מתאים ממקור רקמתי אחר כמו מערכת החיסון, כלי הדם ומערכת העצבים, אזי תרבית תאי מוך טהורה תוביל למבוי סתום. לכן, ניסויים in vivo הם מאוד הכרחי התייחסות.

עכברים הפכו יותר ויותר לבחירה נפוצה במחקר דלקת in vivo בשל עלות-תועלת, פוריות גבוהה וחיוניות. עם זאת, פרוטוקול מקיף עבור מודל מוך העכברים נעדר כרגע, אשר יכול לשמש התייחסות. גודלם הקטן של העכברים ורגישותם לגירוי מציבים אתגרים משמעותיים במהלך הליכי הניסוי. התבוננות בשיניים הזעירות החבויות עמוק בתוך פי העכבר מחייבת לעתים קרובות שימוש במיקרוסקופ משופע, למרות הנוכחות הנפוצה יותר של מיקרוסקופים שולחניים במעבדות. היעדר פותחן פה דורש סיוע מאחרים. כדי להתמודד עם זה, הקבוצה פיתחה סתימת פיות באמצעות חומרים זמינים שמטרתה לספק פרוטוקול סטנדרטי וניתן לשחזור לבניית מודל פולפיטיס עכברים. מאמר זה מפרט את ההליך, ומכסה הכנה לפני הניתוח, אימוביליזציה, ניתוח חשיפה למוך השן ואיסוף דגימות על עכברי C57. פרוטוקול זה ממליץ על השימוש בסתימת הפה, ומספק מידע על מבנהו, ייצורו ויישומו כדי להקל על חוקרים אחרים לשכפל את ההליך.

Protocol

הליכי הניסוי במחקר זה אושרו על ידי הוועדה האתית של בית הספר לסטומטולוגיה במערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן (WCHSIRB-D-2021-125). עכברי C57BL/6 בוגרים התקבלו מחברת Gempharmatech Experimental Animals, צ'נגדו, סין. כל הכתר של הטוחנת הראשונה המקסילרית מתפרץ 21 יום לאחר הלידה. עכברים לניתוח צריכים להיות מעל 21 ימים עם חיוניות רגילה¹¹. כאן, עכברים בני 6 עד 8 שבועות שימשו לדוגמנות. איור 1 הוא דיאגרמת זרימה שמראה את הפרוטוקול שבו נעשה שימוש.

1. הכנה טרום ניתוחית (איור 2)

1. השג את המכשירים הבאים: מיקרוסקופ סטריאוסקופי, צלחת קיבוע, סרט רפואי, סתימת פיות, בור שיניים זעיר פולשני בקוטר של 0.6 מ"מ, ידית שיניים במהירות גבוהה, קובץ 8# C+, כרית חימום, מזרק 1 מ"ל, כדור צמר גפן סטרילי, מלקחיים לעיניים.
2. להשיג את התרופות הבאות: תערובת הרדמה, משחה וטרינרית.

2. הכנת הפה-גאג

1. לשקול ולהרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית של תמיסת תערובת הרדמה (10% קטמין הידרוכלוריד + 5% קסילזין + 85% מלח איזוטוני סטרילי) במשקל גוף של 0.007 מ"ל / גרם ולאשר הרדמה נכונה בשיטת צביטת הבוהן. החל משחה סיכה אופתלמית על העיניים כדי למנוע פגיעה בעיניים בגלל התייבשות במהלך הניתוח.
   הערה: כובעים רפואיים, מסכות, כפפות וסרבלים והגנה בסיסית אחרת נחוצים. ודא שגם סביבת הניתוח וגם תא העכבר נקיים ובטוחים. כרית חום לתמיכה תרמית לאורך כל ההליך הוא הכרחי.
2. הכינו את סתימת הפה כמתואר להלן (איור 3).
   1. השג את החומרים הבאים: חוט קשת אורתודונטי בקוטר 8 מיקרומטר, צבת כיפוף לולאה צעירה, חותך תיל כבד, עט טוש, מכסה גומי באורך 3 מ"מ וקוטר חתך רוחב של 1 מ"מ.
   2. ראשית, יישרו את חוט הקשת ביד שמאל לצורך קיבוע ואגודל, האצבע המורה של יד ימין מתכופפת מעט כנגד קשת החוט. חזור על פעולה זו מספר פעמים, זה יקל על הכיפוף לזווית התלת מימדית הנכונה.
   3. השתמשו בצבת הכיפוף של לולאת יונג כדי לכופף את הקצה העליון (איור 3G, a-i) של הטרפז (איור 3C, a-l-k-b) באורך של כ-8 מ"מ בנקודת האמצע של חוט החרטום. ודאו שנקודה a (איור 3) נמצאת בקצה מקור הצבת.
   4. אחזו בצבת ביד שמאל, הדקו את הקצה החופשי של חוט הקשת עם אגודל ואצבע ימין, וכופפו את חוט הקשת מנקודה a ליצירת זווית של כ-120°. שכפלו את הפעולה הקודמת בנקודה i (איור 3G). בדוק אם חוט הקשת נמצא במישור אחד על ידי הנחתו על שולחן אופקי מבלי לחטט.
   5. השאירו אורך של כ-9 מ"מ מכל צד (איור 3D, A-B, L-K) וכופפו את הקצה החופשי לזווית של 75° באמצעות אותה מיומנות כמו שלב 2.2.4, תוך הקפדה שכל קצה נמצא במישור אחד. כופפו זווית חריפה זו עם קצה מקור הצבת.
   6. מצא נקודה c במרחק של כ-5 מ"מ מנקודה b. בצע את אותה מיומנות כדי לכופף זווית של 105° בנקודה c. כופפו זווית נוספת של 105° בנקודה d 5 מ"מ מנקודה c. השאירו כ-4.5 מ"מ מנקודה d ומצאו את נקודה e. כופפו את הקצה החופשי בנקודה e ליצירת זווית של כ-100-105° (איור 3E).
      הערה: עכברי C57 בני 6-8 שבועות שבהם השתמשנו היו בערך 20 גרם. המרווח של 5 מ"מ יכול לא רק לתקוע את הלסת העליונה והתחתונה של העכברים מבלי לזוז, אלא גם לא ללחוץ על העור של העכברים ולגרום אי נוחות. אם משתמשים במינים אחרים או בגילים אחרים של עכברים, התאימו את אורך חלקי c-d ו-i-h בהתאם למצב האמיתי (איור 3E,G).
   7. כופפו מדכא לשון נוסף עבור החלק המנדיבולרי (איור 3G, j-i-h-g).
   8. שלבי כיפוף כפולים של חלק a-b-c בחלק l-k-j. הדקו את חלקי i-k ו-k-j בו זמנית וכופפו את הקצה החופשי בנקודה j כדי להפוך אותו אנכי למישור i-k-j. מהדק נקודה i שנמצאת 5 מ"מ מנקודה j, כופף את הקצה החופשי כדי שיהיה מקביל גם למישור i-k-j וגם לחלק c-d (איור 3H).
   9. השאירו אורך של 5 מ"מ מנקודה i, בנקודה h, כופפו את הקשת אנכית לחלק i-h ומקבילה למישור j-i-h. מצא את נקודה g ב 5 מ"מ מנקודה h. מהדקים את מישור j-i-h-g ומכופפים את הקצה החופשי הסימטרי לחלק k-j. לאחר מכן הקצה החופשי אחרי הנקודה f צריך להיות סימטרי לקצה החופשי הנקודתי (איור 3H).
   10. הניחו מכסי גומי בקצה החופשי (איור 3F).

3. אימוביליזציה

1. תקן את שכיבת העכבר על צלחת הקיבוע עם איברים מאובטחים על ידי סרט עור. דחסו את הקצוות החופשיים של הפה-גאג בעזרת האגודל והאצבע המורה.
2. תקן את החותכות הקדמיות של העכבר בחריץ הטרפזי של שתי זרועות. ודא כי הזרוע עם מדכא הלשון הוא עבור mandibula. התאימו את הפה כדי לוודא שלשון העכבר משותקת אך לא איסכמית.

4. הערכת שיניים

1. ודא כי הטוחנת הראשונה המקסילרית לניתוח צריכה להיות נקייה מעששת, טראומה ואודונטוגנזה. ודא שאין אדמומיות, נפיחות או פיסטולה על החניכיים שמסביב. ודאו שהשיניים הנגדיות בריאות וזמינות לשמש כקבוצת ביקורת בריאה.

5. חשיפה לעיסת העץ

1. השתמש בבור שיניים כדי לקדוח בצד הנסתר של הטוחנת הראשונה המקסילרית במהירות של 20,000 סל"ד. ודא כי האמייל הוסר. יש לשמור את הניתוח עם ידית שיניים רק בשכבה רדודה של דנטין כדי למנוע גירוי תרמי מוגזם על רקמת מוך השן¹².
2. במקביל, למנוע התחממות יתר באמצעות מזרק כדי להפיל מלוחים רגילים על השן כל 3 דקות במהלך הניתוח.
3. שים קובץ 8# או 10# C+ במיקום הנמוך ביותר של הבור שנקדח וחדרו דרך הדנטין האחרון כדי לחשוף את תא מוך השן. זו תהיה תחושה ברורה של נפילה כאשר דנטין מקומי מוסר ביסודיות. אין לחטט עמוק מדי, אחרת רקמת מוך השן עלולה להיות מוציאה מתא מוך השן.
4. נקו את השברים סביב השן. להוריד את הפה-גאג; הניתוח הסתיים. השתמש בטוחנת הראשונה המקסילרית הנגדית כבקרה ללא פעולה.

6. טיפול לאחר הניתוח

1. לאחר הניתוח, יש לתת קרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) באופן תת-עורי ולהניח את העכבר על כרית החימום הכימותרמית במצב נוטה עד להחלמה מההרדמה. האכילו את העכברים וספקו מי שתייה. יש לפקח על תהליך ההחלמה. אף בעל חיים אחר לא צריך להיות באותו חדר עד שהעכבר מתאושש לחלוטין.

7. איסוף ואחסון דוגמאות

1. יש להרדים את העכבר עם נקע צוואר הרחם בתנאי הרדמה עמוקה 24 שעות לאחר הניתוח או בכל נקודת זמן אחרת לפי ניסוי⁹. חותכים את שרירי השלד המחוברים למקסילה ולזיגומה בעזרת מספריים אופתלמיים. הסר שלד, עצם קדמית ורקמות רכות והוציא את gnathostegite lamina עם טוחנות מקסילריות.
   הערה: על פי He et al., יש לשבח כי יש לאסוף דגימת דלקת מוך פחות מ -72 שעות לאחר הניתוח כדי למנוע נמק נרחב ברקמת מוך השן¹³.
2. קשת לחלק את gnathostegite לשניים ולאחסן את הרקמה ב 4% paraformaldehyde ב PBS, pH 7.4, ב 4 ° C עבור קיבוע 24h.

8. ניתוח היסטולוגי

1. שטפו את הרקמה במי מלח חוצצים פוספט (PBS) ובטלו אותם בתמיסת הסתיידות יומית של 5% EDTA ו-4% סוכרוז ב-PBS, pH 7.4, ב-4°C למשך 2-4 שבועות¹⁰.
2. הטמע את 1/2 gnathostegite בפרפין וודא הפנים sagittal ללא שיניים הוא בחלק התחתון של קלטות רקמות.
3. חותכים את גוש הפרפין לפרוסות בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום פרפין. התאימו את זווית גוש הפרפין בהתאם למערכת היחסים הפרוקסימלית, הדיסטלית, העליונה והתחתונה שנצפתה במיקרוסקופ כדי להבטיח שניתן יהיה לחתוך את עיסת הכתר המלאה ואת הניקוב של הטוחנת הראשונה.

תוצאות

ההליך המתואר לעיל בוצע בטוחנת הראשונה המקסילרית הימנית של עכברי C57BL/6 בני 3, 6-8 שבועות, ואילו הטוחנות הראשונות המקסילריות השמאליות נשמרו כביקורת. תוצאות היסטולוגיה ואימונופלואורסנציה מבקרה ריקה, דגימות של 12 שעות פולפיטיס ו-24 שעות של פולפיטיס שימשו להדגמה.

בעקבות פרוטוקול של ...

Discussion

כרקמה הרכה הבודדת בתוך השיניים, מוך השן ממלא תפקיד מכריע בשמירה על הפעילות הביולוגית של השן, אך נותר רגיש מאוד. שימור מוך מוך חיוני זה הפך לגישה הראשונית המועדפת בטיפולים האנדודונטיים האחרונים, המחייבים הבנה מקיפה של המנגנונים הדלקתיים של מוך השן¹⁶. התנודות המרחביות-זמניות של ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.