Pulpitis 연구를 위한 새로운 구강 개그를 이용한 Murine Pulp Exposure Model 구축

요약

이 기사에서는 혁신적인 구강 재갈을 사용하여 마우스에서 치수염 모델을 확립하기 위한 간소화된 프로토콜을 제시한 후 후속 조직학적 분석을 제공합니다.

초록

자연 치아 상실의 흔한 원인인 치수염은 염증이 있는 치수의 괴사와 생체 활성 상실을 초래합니다. 치수염의 기저와 효율적인 치료의 기전을 밝히는 것은 근관 치료 연구의 지속적인 초점입니다. 따라서 치수대 내의 염증 과정을 이해하는 것은 치수대 보존을 개선하는 데 매우 중요합니다. 다른 in vitro 실험과 비교했을 때, murine pulpitis 모델은 치수염의 병리학적 진행을 관찰하기 위해 보다 확실하고 유전적으로 다양한 맥락을 제공합니다. 그러나 마우스를 사용하는 것은 비용 효율성과 접근성에도 불구하고 작은 크기, 협응력이 좋지 않고 내성이 낮아 구강 내 및 치과 시술을 복잡하게 만드는 데 어려움이 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 펄프를 노출시키는 구강 재갈의 새로운 설계 및 적용을 도입하여 보다 효율적인 구강 내 절차를 용이하게 합니다. 대부분의 치과 의사가 쉽게 사용할 수 있는 치과 아치로 구성된 구강 재갈은 처음 시술하는 경우에도 수술 준비를 크게 단축할 수 있습니다. Micro-CT, hematoxylin-eosin(HE) 염색 및 면역형광 염색을 사용하여 형태 및 세포 발현의 변화를 확인했습니다. 이 기사의 목적은 연구자들이 이 새로운 구강 재갈을 사용하여 치수염 염증 모델을 만들기 위한 보다 재현 가능하고 덜 까다로운 절차를 확립하도록 돕는 것입니다.

서문

치아의 필수적인 부분인 치수는 영양 공급, 상아질 형성, 감각 기능 및 방어 반응과 같은 여러 필수 기능을 담당합니다¹. 그럼에도 불구하고, 단단한 조직으로 둘러싸인 치수는 깊은 우식증, 치수염, 외상 또는 후속 치료로 인한 부상 및 손상에 취약하다 ^2,3. 기능성 치수가 없으면 치아 취약성의 위험이 증가합니다⁴. 더욱이, 젊은 영구치에서 치수의 활력 상실은 치아 성숙에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 현재의 의치 기술은 건강한 치수가 제공하는 신경 피드백을 복원하지 못합니다⁴. 이러한 상황으로 인해 연구자들은 단순한 제거를 넘어 염증이 있는 치수를 관리하기 위한 대체 솔루션을 모색하게 되었습니다.

2007년 Murray et al.은 재생 근관 치료에 조직 공학을 적용하기 시작했으며, 이로 인해 치수량 보존 및 재생에 대한 관심이 높아졌습니다⁵. 그러나 염증이 있는 치수는 세포가 염증 세포를 모집하는 IL-6와 같은 염증 인자를 방출하여 세포 괴사, 치수 활력 상실 및 기능 회복 합병증을 유발하기 때문에 문제가 됩니다 ^6,7. 따라서 염증 및 관련 세포 사멸을 이해하는 것은 필수 펄프 보존의 발전을 위해 매우 중요합니다. in vivo 또는 in vitro ^8,9에서 염증 펄프의 분자 생물학을 탐구하기 위해 수행된 여러 가지 실험이 있습니다. 2D 또는 3D 세포 배양과 같은 시험관 내 실험은 수년 동안 개발되어 왔으며 염증 인자에 대한 펄프 세포의 반응을 테스트하는 데 널리 사용되고 있지만 이러한 실험은 펄프 조직과 전신 면역 체계¹⁰ 간의 상호 작용을 반영할 수 없습니다. 연구 중인 현상이 면역, 혈관 및 신경계와 같은 다른 조직 기원의 세포에서 파생된 경우 순수한 펄프 세포 배양은 막다른 골목으로 이어질 것입니다. 따라서 in vivo 실험은 매우 필요하고 참조적입니다.

마우스는 비용 효율성, 높은 생식력 및 활력으로 인해 생체 내 염증 연구에서 점점 더 일반적인 선택이 되었습니다. 그러나 현재 마우스 치수염 모델에 대한 포괄적인 프로토콜이 없어 참고 자료로 사용할 수 있습니다. 마우스의 작은 크기와 자극에 대한 민감성은 실험 절차 중에 상당한 문제를 제기합니다. 쥐의 입 깊숙이 숨겨져 있는 미세한 이빨을 관찰하려면 종종 캔틸레버 현미경을 사용해야 하지만, 실험실에서 데스크톱 현미경이 더 흔하게 사용됩니다. 입 벌림이 없으면 다른 사람의 도움이 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 이 그룹은 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 마우스 펄피티스 모델을 구축하기 위한 표준화되고 재현 가능한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 하는 구강 재갈을 고안했습니다. 이 기사에서는 수술 전 준비, 고정화, 펄프 노출 수술 및 C57 마우스에 대한 샘플 수집을 다루는 절차에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 구강 재갈의 사용을 권장하며, 다른 연구자들이 절차를 복제할 수 있도록 구조, 생산 및 적용에 대한 정보를 제공합니다.

프로토콜

이 연구의 실험 절차는 쓰촨 대학교 화화서부 구강학 학교 윤리위원회(WCHSIRB-D-2021-125)의 승인을 받았습니다. 성체 C57BL/6 마우스는 중국 청두에 있는 Gempharmatech Experimental Animals Company에서 수득하였다. 상악 제1대구치의 크라운 전체는 출생 후 21일 후에 맹출합니다. 수술용 마우스는 생후 21일 이상이어야 하며 생명력이 정상이어야 한다¹¹. 여기에서는 6주에서 8주 된 쥐를 모델링에 사용했습니다. 그림 1 은 사용된 프로토콜을 보여주는 흐름도입니다.

1. 수술 전 준비(그림 2)

1. 다음 기구를 얻을 수 있습니다: 입체 현미경, 고정판, 의료용 테이프, 구강 재갈, 직경 0.6mm의 최소 침습 치과용 버, 치과용 고속 치과용 핸드피스, 8# C+ 파일, 가열 패드, 1mL 주사기, 멸균 면봉, 안구 집게.
2. 다음 약물을 얻으십시오 : 마취 믹스, 수의학 연고.

2. 입 재갈의 준비

1. 체중의 0.007mL/g에서 마취 혼합액(10% 케타민 염산염 + 5% 자일라진 + 85% 멸균 등장성 식염수)을 복강내 주사하여 마우스의 무게를 측정하고 마취하고 발가락 꼬집기 방법을 통해 적절한 마취를 확인합니다. 수술 중 건조로 인한 눈 부상을 방지하기 위해 눈에 안과 윤활 연고를 바르십시오.
   알림: 의료용 모자, 마스크, 장갑, 작업복 및 기타 기본 보호가 필요합니다. 수술 환경과 마우스 챔버가 모두 깨끗하고 안전한지 확인하십시오. 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 위한 열 패드가 필요합니다.
2. 아래 설명에 따라 구강 재갈을 준비합니다(그림 3).
   1. 다음 재료를 얻으십시오 : 직경 8 μm의 교정 아치 와이어, 젊은 루프 벤딩 플라이어, 무거운 와이어 커터, 마커 펜, 길이 3mm 및 단면적 직경 1mm의 고무 캡.
   2. 먼저 왼손으로 아치 와이어를 곧게 펴고 엄지손가락으로 오른손의 검지를 와이어의 호에 약간 구부립니다. 이 작업을 여러 번 반복하면 올바른 3차원 각도로 구부리는 것이 용이합니다.
   3. Yong 루프 벤딩 플라이어를 사용하여 보우 와이어의 중간 지점에서 약 3mm 길이의 사다리꼴(그림 3C, a-l-k-b)의 상단 가장자리(그림 8G, ai)를 구부립니다. 점 a(그림 3)가 플라이어 부리의 가장자리에 있는지 확인합니다.
   4. 왼손으로 펜치를 잡고 clamp 오른손 엄지와 검지로 활 와이어의 다른 쪽 끝을 잡고 a 지점에서 활 와이어를 구부려 약 120° 각도를 만듭니다. 지점 i에서 이전 작업을 복제합니다(그림 3G). 아치 와이어가 한 평면에 있는지 들어 올리지 않고 수평 테이블 위에 올려 놓으십시오.
   5. 각 측면에 약 9mm의 길이를 남겨 두고(그림 3D, ab, lk) 2.2.4단계와 동일한 기술을 사용하여 자유 끝을 75° 각도로 구부리면서 각 모서리가 한 평면에 있는지 확인합니다. 플라이어 부리의 끝으로 이 예각을 구부립니다.
   6. 점 b에서 약 5mm 떨어진 점 c를 찾습니다. 동일한 기술을 따라 점 c에서 105° 각도로 구부립니다. 점 c에서 105mm 지점 d에서 5° 각도로 또 다른 구부립니다. 점 d에서 약 4.5mm 떨어진 곳에서 점 e를 찾습니다. 점 e에서 자유 끝을 구부려 약 100 -105°의 각도를 형성합니다(그림 3E).
      참고: 우리가 사용한 6-8주 된 C57 마우스는 약 20g이었습니다. 5mm의 간격은 생쥐의 위턱과 아래턱을 움직이지 않고 끼일 수 있을 뿐만 아니라 생쥐의 피부를 눌러 불편함을 유발하지 않습니다. 다른 종이나 연령의 마우스를 사용하는 경우 실제 상황에 따라 cd 및 i-h 부분의 길이를 조정하십시오(그림 3E,G).
   7. 하악 부분을 위해 추가 텅 디프레터를 구부립니다(그림 3G, j-i-h-g).
   8. l-k-j 부품에서 a-b-c 부품의 굽힘 단계를 복제합니다. Clamp i-k 및 k-j 부품을 동시에 하고 점 j에서 자유 끝을 구부려 i-k-j 평면에 수직으로 만듭니다. 점 j에서 5mm 떨어진 클램프 점 i는 자유 끝을 구부려 i-k-j 평면과 c-d 부품과 평행하게 만듭니다(그림 3H).
   9. 점 h에서 점 i에서 5mm 길이를 두고 아치를 i-h 부분까지 수직으로, j-i-h 평면에 평행하게 구부립니다. 점 h에서 5mm 떨어진 점 g를 찾습니다. Clamp j-i-h-g 평면을 k-j 부품에 대칭으로 자유 끝을 구부립니다. 그런 다음 점 f 뒤의 자유 끝은 점 e-free 끝과 대칭이어야 합니다(그림 3H).
   10. 다른 쪽 끝에 고무 캡을 끼웁니다(그림 3F).

3. 부동자세

1. 가죽 테이프로 고정된 팔다리로 고정된 고정판에 마우스를 누운 상태로 고정합니다. 엄지와 검지로 입 재갈의 자유단을 압박합니다.
2. 마우스 앞니를 두 팔의 사다리꼴 홈에 고정합니다. 텅 디프레저가 있는 팔이 하악관용인지 확인하십시오. 마우스 혀가 움직이지 않지만 허혈성이 없는지 확인하기 위해 입 재갈을 조정합니다.

4. 치아 평가

1. 수술을 위한 상악 제1대구치에 치아우식증, 외상 및 치골 형성이 없어야 합니다. 주변 치은에 발적, 부기 또는 누공이 없는지 확인하십시오. 반대쪽 치아가 건강하고 건강한 대조군 역할을 할 수 있는지 확인하십시오.

5. 펄프 노출

1. 치과 버를 사용하여 20,000rpm의 속도로 상악 첫 번째 대구치의 교합면을 뚫습니다. 법랑질이 제거되었는지 확인하십시오. 치과 치수 조직에 과도한 열 자극이 가해지는 것을 방지하기 위해 치과 치과의 얕은 상아질층에서만 치과용 핸드피스로 작업을 유지하십시오¹².
2. 동시에 수술 중 3분마다 주사기를 사용하여 치아에 생리 식염수를 떨어뜨려 과열을 방지하십시오.
3. 뚫린 구덩이의 가장 낮은 위치에 8# 또는 10# C+ 파일을 놓고 마지막 상아질을 뚫어 치수실을 노출시킵니다. 국소 상아질을 철저히 제거했을 때 떨어지는 느낌이 뻔할 것입니다. 너무 깊게 조사하지 마십시오. 그렇지 않으면 치수 조직이 치수실에서 나올 수 있습니다.
4. 치아 주변의 파편을 청소하십시오. 입 재갈을 벗으십시오. 수술이 끝났습니다. 반대쪽 상악 첫 번째 대구치를 수술 없이 대조군으로 사용합니다.

6. 수술 후 관리

1. 수술 후 카프로펜(5mg/kg)을 피하주사하고 마취가 회복될 때까지 마우스를 엎드린 자세로 화학열 가열 패드에 올려놓습니다. 쥐에게 먹이를 주고 식수를 제공합니다. 복구 프로세스를 감독해야 합니다. 쥐가 완전히 회복될 때까지 다른 동물이 같은 방에 있어서는 안 됩니다.

7. 시료 채취 및 보관

1. 자궁경부 탈구가 있는 쥐를 수술 후 24시간 후 또는 실험⁹에 따라 다른 시점에 깊은 마취 상태에서 안락사시킨다. 상악골과 광대에 붙어있는 골격근을 안과 가위로 자릅니다. 골격, 전두골 및 연조직을 제거하고 상악 어금니가 있는 lamina gnathostecite를 제거합니다.
   참고: He et al.에 따르면, 치수 조직의 광범위한 괴사를 피하기 위해 수술 후 72시간 이내에 치수염 샘플을 채취해야 한다는 것이 권장됩니다¹³.
2. gnathostegite를 시상식으로 반으로 나누고 조직을 24시간 고정을 위해 4°C에서 PBS, pH 7.4의 4% 파라포름알데히드에 저장합니다.

8. 조직학적 분석

1. 인산염 완충 식염수(PBS)로 조직을 세척하고 4-4주 동안 4°C에서 PBS(pH 7.4)로 매일 변경되는 5% EDTA 및 4% 자당의 석회질 제거 용액으로 석회질을 제거합니다¹⁰.
2. 파라핀에 1/2 gnathostegite를 넣고 이빨이 없는 시상면이 조직 카세트 바닥에 있는지 확인합니다.
3. 파라핀 마이크로톰으로 파라핀 블록을 5μm 두께로 자릅니다. 현미경에서 관찰된 근위부, 원위부, 상부 및 하부 관계에 따라 파라핀 블록의 각도를 조정하여 첫 번째 어금니의 완전한 크라운 펄프와 천공을 절단할 수 있도록 합니다.

결과

상술한 시술은 3주령, 6-8주령 C57BL/6 마우스의 우측 상악 제1대구치에 수행하였고, 좌측 상악 제1대구치는 대조군으로 보존하였다. 블랭크 대조군, 12시간 치수염 및 24시간 치수염 샘플의 조직학 및 면역형광 결과를 시연에 활용했습니다.

Goldman et ^al.15의 CT 분석 프로토콜에 따라, 도 4 A-C의 micro-CT 및 재구성 모델링을 통해 펄?...

토론

치아 내의 유일한 연조직인 치수는 치아의 생체 활성을 유지하는 데 중요한 역할을 하지만 여전히 매우 민감합니다. 이 중요한 치수의 보존은 최근 근관 치료에서 선호되는 초기 접근법이 되었으며, 이에 따라 치수의 염증 메커니즘에 대한 포괄적인 이해가 필요하게 되었다¹⁶. 염증성 미세환경의 시공간 변동과 치수염에서 상주 세포 유형 간의 상호 작용은 in vitro 연구를 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.