Etablissement d’un modèle d’exposition à la pulpe murine avec un nouveau bâillon pour la recherche sur la pulpite

Résumé

Cet article présente un protocole simplifié pour établir un modèle de pulpite chez la souris à l’aide d’un bâillon buccal innovant, suivi d’une analyse histologique ultérieure.

Résumé

La pulpite, une cause fréquente de perte naturelle de dents, entraîne une nécrose et une perte de bioactivité dans la pulpe dentaire enflammée. L’élucidation des mécanismes sous-jacents à la pulpite et son traitement efficace est un objectif permanent de la recherche endodontique. Par conséquent, il est essentiel de comprendre le processus inflammatoire dans la pulpe dentaire pour améliorer la préservation de la pulpe. Par rapport à d’autres expériences in vitro , un modèle de pulpite murine offre un contexte plus authentique et génétiquement diversifié pour observer la progression pathologique de la pulpite. Cependant, l’utilisation de souris, malgré leur rentabilité et leur accessibilité, pose des difficultés en raison de leur petite taille, de leur mauvaise coordination et de leur faible tolérance, ce qui complique les procédures intrabuccales et dentaires. Ce protocole introduit une nouvelle conception et l’application d’un bâillon buccal pour exposer la pulpe de souris, facilitant ainsi des procédures intra-orales plus efficaces. Le bâillon buccal, composé d’une arcade dentaire, est facilement accessible à la plupart des dentistes et peut accélérer considérablement la préparation chirurgicale, même pour les premières procédures. La micro-tomodensitométrie, la coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) et la coloration par immunofluorescence ont été utilisées pour identifier les changements dans la morphologie et l’expression cellulaire. L’objectif de cet article est d’aider les chercheurs à établir une procédure plus reproductible et moins exigeante pour créer un modèle d’inflammation de la pulpe à l’aide de ce nouveau bâillon buccal.

Introduction

La pulpe dentaire, partie intégrante de la dent, est responsable de plusieurs fonctions essentielles telles que l’apport en nutriments, la formation de dentine, la fonction sensorielle et les réactions de défense¹. Néanmoins, la pulpe dentaire, entourée de tissus durs, est sensible aux blessures et aux dommages causés par les caries profondes, la pulpite, les traumatismes ou les thérapies ultérieures ^2,3. L’absence de pulpe dentaire fonctionnelle augmente le risque de fragilité dentaire⁴. De plus, la perte de vitalité de la pulpe chez les jeunes dents permanentes peut nuire à la maturation des dents, et les techniques actuelles de prothèse dentaire ne parviennent pas à restaurer la rétroaction neuronale offerte par une pulpe saine⁴. Cette situation a conduit les chercheurs à explorer des solutions alternatives pour gérer la pulpe enflammée au-delà de la simple élimination.

En 2007, Murray et al. ont initié l’application de l’ingénierie tissulaire dans l’endodontie régénérative, suscitant ainsi un intérêt accru pour la préservation et la régénération de la pulpe⁵. Cependant, l’inflammation du tissu pulpaire pose un défi car les cellules libèrent des facteurs inflammatoires tels que l’IL-6, qui recrutent les cellules inflammatoires et entraînent une nécrose cellulaire, une perte de vitalité de la pulpe et des complications dans la récupération fonctionnelle ^6,7. La compréhension de l’inflammation et de la mort cellulaire associée est donc cruciale pour les progrès dans la préservation de la pulpe vitale. Un certain nombre d’expériences ont été menées pour explorer la biologie moléculaire de la pulpe enflammée in vivo ou in vitro ^8,9. Bien que des expériences in vitro telles que les cultures cellulaires 2D ou 3D aient été développées pendant des années et deviennent matures et largement utilisées pour tester les réactions des cellules pulpaires aux facteurs inflammatoires, ces expériences ne peuvent pas refléter l’interaction entre le tissu pulpaire et le système immunitaire systémique¹⁰. Si le phénomène étudié est dérivé de cellules d’autres origines tissulaires comme le système immunitaire, vasculaire et nerveux, alors la culture de cellules pulpaires pures conduira à une impasse. Par conséquent, les expériences in vivo sont très nécessaires et référentielles.

Les souris sont de plus en plus devenues un choix courant dans la recherche sur l’inflammation in vivo en raison de leur rentabilité, de leur fertilité élevée et de leur vitalité. Cependant, il n’existe actuellement aucun protocole complet pour le modèle de pulpite chez la souris, qui puisse servir de référence. La petite taille des souris et leur sensibilité à la stimulation posent des défis importants lors des procédures expérimentales. L’observation des minuscules dents dissimulées profondément dans la bouche de la souris nécessite souvent l’utilisation d’un microscope en porte-à-faux, malgré la présence plus courante de microscopes de bureau dans les laboratoires. L’absence d’ouvre-bouche nécessite l’aide d’autres personnes. Pour résoudre ce problème, le groupe a conçu un bâillon en utilisant des matériaux facilement disponibles qui vise à fournir un protocole standardisé et reproductible pour la construction du modèle de pulpite chez la souris. Cet article détaille la procédure, couvrant la préparation préopératoire, l’immobilisation, la chirurgie d’exposition à la pulpe et le prélèvement d’échantillons sur des souris C57. Ce protocole recommande l’utilisation du bâillon buccal, fournissant des informations sur sa structure, sa production et son application pour faciliter la reproduction de la procédure par d’autres chercheurs.

Protocole

Les procédures expérimentales de cette étude ont été approuvées par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de l’Ouest de la Chine de l’Université du Sichuan (WCHSIRB-D-2021-125). Les souris C57BL/6 adultes ont été obtenues auprès de la Gempharmatech Experimental Animals Company, à Chengdu, en Chine. Toute la couronne de la première molaire maxillaire fait éruption 21 jours après la naissance. Les souris pour la chirurgie doivent avoir plus de 21 jours avec une vitalité normale¹¹. Ici, des souris âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées pour la modélisation. La figure 1 est un organigramme illustrant le protocole utilisé.

1. Préparation préopératoire (Figure 2)

1. Procurez-vous les instruments suivants : microscope stéréoscopique, plaque de fixation, ruban médical, bâillon buccal, fraise dentaire mini-invasive d’un diamètre de 0,6 mm, pièce à main dentaire à grande vitesse, lime 8 # C+ , coussin chauffant, seringue de 1 ml, boule de coton stérile, pince oculaire.
2. Procurez-vous les médicaments suivants : mélange d’anesthésie, pommade vétérinaire.

2. Préparation du bâillon buccal

1. Peser et anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d’une solution de mélange d’anesthésie (chlorhydrate de kétamine à 10 % + xylazine à 5 % + solution saline isotonique stérile à 85 %) à 0,007 mL/g de poids corporel et confirmer l’anesthésie appropriée par pincement des orteils. Appliquez une pommade lubrifiante ophtalmique sur les yeux pour prévenir les blessures oculaires dues à la dessiccation pendant le fonctionnement.
   REMARQUE : Des chapeaux médicaux, des masques, des gants et des combinaisons et d’autres protections de base sont nécessaires. Assurez-vous que l’environnement de la chirurgie et la chambre de la souris sont propres et sûrs. Un coussin chauffant pour le soutien thermique tout au long de la procédure est nécessaire.
2. Préparez le bâillon buccal comme décrit ci-dessous (Figure 3).
   1. Procurez-vous les matériaux suivants : Fil d’arc orthodontique d’un diamètre de 8 μm, pince à cintrer jeune boucle, coupe-fil lourd, marqueur, capuchon en caoutchouc d’une longueur de 3 mm et d’un diamètre de section transversale de 1 mm.
   2. Tout d’abord, redressez le fil de l’arc avec la main gauche pour la fixation et le pouce, l’index de la main droite pliez légèrement contre l’arc du fil. Répétez cette action plusieurs fois, cela facilitera la flexion à l’angle tridimensionnel correct.
   3. À l’aide de la pince à cintrer à boucle Yong, pliez le bord supérieur (figure 3G, a-i) du trapèze (figure 3C, a-l-k-b) d’environ 8 mm de long au milieu du fil de l’arc. Assurez-vous que le point a (Figure 3) se trouve sur le bord du bec de la pince.
   4. Tenez la pince de la main gauche, serrez l’extrémité libre du fil d’arc avec le pouce et l’index droits et pliez le fil d’arc à partir du point a pour faire un angle d’environ 120°. Dupliquez l’action précédente au point i (Figure 3G). Vérifiez si le fil de l’arc est sur un plan en le posant sur une table horizontale sans faire levier.
   5. Laissez environ 9 mm de longueur de chaque côté (figure 3D, a-b, l-k) et pliez l’extrémité libre à un angle de 75° en utilisant la même habileté que à l’étape 2.2.4, tout en vous assurant que chaque bord est sur un seul plan. Pliez cet angle aigu avec la pointe du bec de la pince.
   6. Trouvez le point c à environ 5 mm du point b. Suivez la même compétence pour plier un angle de 105° sur le point c. Pliez un autre angle de 105° au point d à 5 mm du point c. Laissez environ 4,5 mm du point d et trouvez le point e. Pliez l’extrémité libre au point e pour former un angle d’environ 100 à 105° (Figure 3E).
      REMARQUE : Les souris C57 âgées de 6 à 8 semaines que nous avons utilisées pesaient environ 20 g. L’espacement de 5 mm pourrait non seulement coincer les mâchoires supérieure et inférieure des souris sans bouger, mais aussi ne pas appuyer sur la peau des souris et causer de l’inconfort. Si d’autres espèces ou âges de souris sont utilisés, veuillez ajuster la longueur des parties c-d et i-h en fonction de la situation réelle (Figure 3E,G).
   7. Pliez un abaisse-langue supplémentaire pour la partie mandibulaire (Figure 3G, j-i-h-g).
   8. Dupliquez les étapes de pliage d’une pièce a-b-c sur une pièce l-k-j. Serrez les pièces i-k et k-j en même temps et pliez l’extrémité libre au point j pour la rendre verticale par rapport au plan i-k-j. Le point de serrage i, qui se trouve à 5 mm du point j, pliez l’extrémité libre pour la rendre parallèle au plan i-k-j et à la pièce c-d (figure 3H).
   9. Laissez une longueur de 5 mm à partir du point i, au point h, pliez l’arc verticalement à la partie i-h et parallèle au plan j-i-h. Trouvez le point g à 5 mm du point h. Serrez le plan j-i-h-g et pliez l’extrémité libre symétriquement à la pièce k-j. Ensuite, l’extrémité libre après le point f doit être symétrique à l’extrémité libre du point e (Figure 3H).
   10. Placez des capuchons en caoutchouc sur l’extrémité libre (Figure 3F).

3. L’immobilisation

1. Fixez la souris en décubitus dorsal sur la plaque de fixation avec les membres fixés par du ruban adhésif. Compressez les extrémités libres du bâillon buccal avec le pouce et l’index.
2. Fixez les incisives avant de la souris dans la rainure trapézoïdale de deux bras. Assurez-vous que le bras avec l’abaisse-langue est pour la mandibule. Ajustez le bâillon buccal pour vous assurer que la langue de la souris est immobilisée mais pas ischémique.

4. Évaluation des dents

1. Assurez-vous que la première molaire maxillaire de la chirurgie doit être exempte de caries dentaires, de traumatismes et d’odontogenèse. Assurez-vous qu’il n’y a pas de rougeur, d’enflure ou de fistule sur la gencive environnante. Assurez-vous que les dents opposées sont saines et disponibles pour agir comme groupe témoin sain.

5. Exposition à la pulpe

1. Utilisez la fraise dentaire pour percer du côté occlusal de la première molaire maxillaire à une vitesse de 20 000 tr/min. Assurez-vous que l’émail est enlevé. Conservez l’opération avec la pièce à main dentaire uniquement dans une couche peu profonde de dentine afin d’éviter une stimulation thermique excessive sur le tissu de la pulpe dentaire¹².
2. Dans le même temps, évitez la surchauffe en utilisant une seringue pour déposer une solution saline normale sur la dent toutes les 3 minutes pendant l’opération.
3. Mettez une lime 8 # ou 10 # C+ sur la position la plus basse de la fosse percée et percez la dernière dentine pour exposer la chambre pulpaire. Ce sera une sensation évidente de chute lorsque la dentine locale sera complètement éliminée. Ne sondez pas trop profondément, sinon le tissu de la pulpe dentaire pourrait être sorti de la chambre pulpaire.
4. Nettoyez les fragments autour de la dent. Enlevez le bâillon ; L’opération est terminée. Utilisez la première molaire maxillaire opposée comme commande sans opération.

6. Soins postopératoires

1. Après la chirurgie, administrez du carprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée et placez la souris sur le coussin chauffant chimiothermique en position couchée jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie. Nourrissez les souris et donnez-leur de l’eau potable. Le processus de récupération doit être supervisé. Aucun autre animal ne doit se trouver dans la même chambre jusqu’à ce que la souris soit complètement rétablie.

7. Collecte et stockage des échantillons

1. Euthanasier la souris atteinte d’une luxation cervicale sous anesthésie profonde 24 h après l’opération ou à tout autre moment selon l’expérience⁹. Coupez les muscles du squelette attachés au maxillaire et au zygoma avec des ciseaux ophtalmiques. Retirez le squelette, l’os frontal et les tissus mous et retirez la gnathostégite lamina avec les molaires maxillaires.
   REMARQUE : Selon He et al., il est recommandé que l’échantillon de pulpite soit prélevé moins de 72 heures après la chirurgie pour éviter une nécrose étendue dans le tissu de la pulpe dentaire¹³.
2. Divisez sagittairement la gnathostégite en deux et stockez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pH 7,4, à 4 °C pour une fixation de 24h.

8. Analyse histologique

1. Lavez les tissus avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et détartrez-les dans une solution de détartrage à 5 % d’EDTA et de saccharose à 4 % de PBS, pH 7,4, à 4 °C pendant 2 à 4 semaines¹⁰.
2. Incorporez la 1/2 gnathostégite dans la paraffine et assurez-vous que la face sagittale sans dents se trouve au fond des cassettes de tissus.
3. Coupez le bloc de paraffine en tranches de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome de paraffine. Ajustez l’angle du bloc de paraffine en fonction de la relation proximale, distale, supérieure et inférieure observée au microscope pour vous assurer que la pulpe de la couronne complète et la perforation de la première molaire peuvent être coupées.

Résultats

La procédure décrite ci-dessus a été réalisée sur la première molaire maxillaire droite de 3 souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines, tandis que les premières molaires maxillaires gauches ont été préservées comme témoin. Les résultats d’histologie et d’immunofluorescence à partir d’échantillons de contrôle à blanc, de pulpite à 12 h et de pulpite à 24 h ont été utilisés pour la démonstration.

Conformément au protocole d’analyse par tomodensitométrie de Goldm...

Discussion

En tant que tissu mou solitaire à l’intérieur des dents, la pulpe dentaire joue un rôle crucial dans le maintien de la bioactivité de la dent, mais reste très sensible. La préservation de cette pulpe vitale est devenue l’approche initiale privilégiée dans les traitements endodontiques récents, nécessitant une compréhension complète des mécanismes inflammatoires de la pulpe dentaire¹⁶. La fluctuation spatio-temporelle du microenvironnement inflammatoire et les interactions entre le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.