Establecimiento de un modelo de exposición a la pulpa murina con una mordaza bucal novedosa para la investigación de la pulpitis

Resumen

En este artículo se presenta un protocolo simplificado para establecer un modelo de pulpitis en ratones utilizando una mordaza bucal innovadora, seguido de un análisis histológico posterior.

Resumen

La pulpitis, una causa común de pérdida de dientes naturales, conduce a la necrosis y a la pérdida de bioactividad en la pulpa dental inflamada. Desentrañar los mecanismos subyacentes a la pulpitis y su tratamiento eficiente es un enfoque continuo de la investigación endodóntica. Por lo tanto, comprender el proceso inflamatorio dentro de la pulpa dental es vital para mejorar la conservación de la pulpa. En comparación con otros experimentos in vitro , un modelo de pulpitis murina ofrece un contexto más auténtico y genéticamente diverso para observar la progresión patológica de la pulpitis. Sin embargo, el uso de ratones, a pesar de su rentabilidad y accesibilidad, plantea dificultades debido a su pequeño tamaño, mala coordinación y baja tolerancia, lo que complica los procedimientos intraorales y dentales. Este protocolo introduce un diseño novedoso y la aplicación de una mordaza bucal para exponer la pulpa del ratón, lo que facilita procedimientos intraorales más eficientes. La mordaza bucal, compuesta por un arco dental fácilmente disponible para la mayoría de los dentistas y puede acelerar significativamente la preparación quirúrgica, incluso para los procedimientos por primera vez. Se utilizaron micro-TC, tinción con hematoxilina-eosina (HE) y tinción con inmunofluorescencia para identificar cambios en la morfología y la expresión celular. El objetivo de este artículo es ayudar a los investigadores a establecer un procedimiento más reproducible y menos exigente para crear un modelo de inflamación pulpar utilizando esta novedosa mordaza bucal.

Introducción

La pulpa dental, una parte integral del diente, es responsable de múltiples funciones esenciales, como el suministro de nutrientes, la formación de dentina, la función sensorial^{y las reacciones} de defensa. Sin embargo, la pulpa dental, rodeada de tejido duro, es susceptible a lesiones y daños por caries profundas, pulpitis, traumatismos o terapias posteriores ^2,3. La ausencia de pulpa dental funcional aumenta el riesgo de fragilidad dental⁴. Además, la pérdida de vitalidad de la pulpa en los dientes permanentes jóvenes puede afectar negativamente a la maduración de los dientes, y las técnicas actuales de dentaduras postizas no logran restaurar la retroalimentación neuronal que ofrece una pulpa sana⁴. Esta situación ha llevado a los investigadores a explorar soluciones alternativas para el manejo de la pulpa inflamada más allá de la mera eliminación.

En 2007, Murray et al. iniciaron la aplicación de la ingeniería de tejidos en la endodoncia regenerativa, lo que despertó un mayor interés en la conservación y regeneración de la pulpa⁵. Sin embargo, el tejido pulpar inflamado presenta un desafío ya que las células liberan factores inflamatorios como la IL-6, que reclutan células inflamatorias y dan lugar a necrosis celular, pérdida de vitalidad pulpar y complicaciones en la recuperación funcional ^6,7. Por lo tanto, comprender la inflamación y la muerte celular asociada es crucial para los avances en la preservación de la pulpa vital. Hay una serie de experimentos que se han llevado a cabo para explorar la biología molecular de la pulpa inflamada in vivo o in vitro ^8,9. Aunque los experimentos in vitro como los cultivos celulares 2D o 3D se han desarrollado durante años y se están volviendo maduros y ampliamente utilizados para probar las reacciones de las células pulpares a los factores inflamatorios, estos experimentos no pueden reflejar la interacción entre el tejido pulpar y el sistema inmune sistémico¹⁰. Si el fenómeno que se estudia se deriva de células de otros tejidos como el sistema inmunológico, vascular y nervioso, entonces el cultivo de células de pulpa pura conducirá a un callejón sin salida. Por lo tanto, los experimentos in vivo son muy necesarios y referenciales.

Los ratones se han convertido cada vez más en una opción común en la investigación de la inflamación in vivo debido a su rentabilidad, alta fertilidad y vitalidad. Sin embargo, actualmente no existe un modelo de protocolo completo para la pulpitis en ratones, que pueda servir de referencia. El pequeño tamaño de los ratones y su sensibilidad a la estimulación plantean desafíos significativos durante los procedimientos experimentales. La observación de los minúsculos dientes ocultos en lo profundo de la boca del ratón a menudo requiere el uso de un microscopio en voladizo, a pesar de la presencia más común de microscopios de escritorio en los laboratorios. La ausencia de un abridor de boca requiere la ayuda de otras personas. Para hacer frente a esto, el grupo ha ideado una mordaza bucal utilizando materiales fácilmente disponibles que tiene como objetivo proporcionar un protocolo estandarizado y reproducible para construir el modelo de pulpitis de ratones. Este artículo detalla el procedimiento, cubriendo la preparación preoperatoria, la inmovilización, la cirugía de exposición pulpar y la recolección de muestras en ratones C57. Este protocolo recomienda el uso de la mordaza bucal, proporcionando información sobre su estructura, producción y aplicación para facilitar a otros investigadores la replicación del procedimiento.

Protocolo

Los procedimientos experimentales de este estudio fueron aprobados por el comité de ética de la Escuela de Estomatología de China Occidental de la Universidad de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-125). Se obtuvieron ratones adultos C57BL/6 de Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China. Toda la corona del primer molar maxilar erupciona 21 días después del nacimiento. Los ratones para cirugía deben tener más de 21 días de edad con una vitalidad normal^{de 11}. Aquí, se utilizaron ratones de 6 a 8 semanas de edad para modelar. La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra el protocolo utilizado.

1. Preparación preoperatoria (Figura 2)

1. Obtenga los siguientes instrumentos: Microscopio estereoscópico, placa de fijación, cinta médica, mordaza bucal, fresa dental mínimamente invasiva con un diámetro de 0,6 mm, pieza de mano dental de alta velocidad, lima 8# C +, almohadilla térmica, jeringa de 1 ml, bola de algodón estéril, pinzas oculares.
2. Obtenga los siguientes medicamentos: mezcla de anestesia, ungüento veterinario.

2. Preparación de la mordaza bucal

1. Pesar y anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de solución de mezcla anestésica (10% de clorhidrato de ketamina + 5% de xilacina + 85% de solución salina isotónica estéril) a 0,007 mL/g de peso corporal y confirmar la anestesia adecuada mediante el método de pinzamiento del dedo del pie. Aplique ungüento lubricante oftálmico en los ojos para prevenir lesiones oculares debido a la desecación durante la operación.
   NOTA: Son necesarios gorros médicos, mascarillas, guantes y overoles y otra protección básica. Asegúrese de que tanto el entorno quirúrgico como la cámara del ratón estén limpios y seguros. Es necesaria una almohadilla térmica para soporte térmico durante todo el procedimiento.
2. Prepare la mordaza bucal como se describe a continuación (Figura 3).
   1. Obtenga los siguientes materiales: alambre de arco ortodóntico con un diámetro de 8 μm, alicate de doblado de bucle joven, cortador de alambre grueso, rotulador, tapa de goma con una longitud de 3 mm y un diámetro de sección transversal de 1 mm.
   2. Primero, enderece el arco de alambre con la mano izquierda para la fijación y el pulgar, el dedo índice de la mano derecha se dobla ligeramente contra el arco del alambre. Repita esta acción varias veces, facilitará la flexión al ángulo tridimensional correcto.
   3. Utilice el alicate de doblado de bucle Yong para doblar el borde superior (Figura 3G, a-i) del trapecio (Figura 3C, a-l-k-b) de unos 8 mm de largo en el punto medio del alambre del arco. Asegúrese de que el punto a (Figura 3) esté en el borde del pico del alicate.
   4. Sostenga los alicates con la mano izquierda, sujete el extremo libre del cable del arco con el pulgar y el índice derechos, y doble el cable del arco desde el punto a para formar un ángulo de aproximadamente 120 °. Duplique la acción anterior en el punto i (Figura 3G). Compruebe si el arco de alambre está en un plano colocándolo sobre una mesa horizontal sin hacer palanca.
   5. Deje unos 9 mm de longitud en cada lado (Figura 3D, a-b, l-k) y doble el extremo libre a un ángulo de 75° utilizando la misma habilidad que en el paso 2.2.4, asegurándose de que cada borde esté en un plano. Dobla este ángulo agudo con la punta del pico del alicate.
   6. Encuentre el punto c a unos 5 mm del punto b. Siga la misma habilidad para doblar un ángulo de 105° en el punto c. Doble otro ángulo de 105° en el punto d a 5 mm del punto c. Deje unos 4,5 mm desde el punto d y encuentre el punto e. Doble el extremo libre en el punto e para formar un ángulo de aproximadamente 100 -105° (Figura 3E).
      NOTA: Los ratones C57 de 6-8 semanas de edad que utilizamos pesaban unos 20 g. El espaciado de 5 mm no solo podría atascar las mandíbulas superior e inferior de los ratones sin moverse, sino que tampoco presionaría la piel de los ratones y causaría molestias. Si se utilizan otras especies o edades de ratones, ajuste la longitud de las partes c-d e i-h de acuerdo con la situación real (Figura 3E, G).
   7. Doble un depresor lingual adicional para la parte mandibular (Figura 3G, j-i-h-g).
   8. Pasos de flexión duplicados de la pieza a-b-c en la pieza l-k-j. Sujete las partes i-k y k-j al mismo tiempo y doble el extremo libre en el punto j para hacerlo vertical al plano i-k-j. Sujete el punto i que está a 5 mm del punto j, doble el extremo libre para que quede paralelo tanto al plano i-k-j como a la parte c-d (Figura 3H).
   9. Deje 5 mm de longitud desde el punto i, en el punto h, doble el arco vertical a la parte i-h y paralelo al plano j-i-h. Encuentre el punto g a 5 mm del punto h. Sujete el plano j-i-h-g y doble el extremo libre simétrico a la parte k-j. Luego, el extremo libre después del punto f debe ser simétrico al extremo libre del punto e (Figura 3H).
   10. Coloque tapas de goma en el extremo libre (Figura 3F).

3. Inmovilización

1. Fije el ratón en decúbito supino en la placa de fijación con las extremidades aseguradas con cinta cutánea. Comprima los extremos libres de la mordaza bucal con el pulgar y el índice.
2. Fije los incisivos frontales del ratón en la ranura trapezoidal de dos brazos. Asegúrese de que el brazo con depresor de lengua sea para la mandíbula. Ajuste la mordaza bucal para asegurarse de que la lengua del ratón esté inmovilizada pero no isquémica.

4. Evaluación dental

1. Asegúrese de que el primer molar maxilar para la cirugía esté libre de caries dental, trauma y odontogénesis. Asegúrese de que no haya enrojecimiento, hinchazón o fístula en la encía circundante. Asegúrese de que los dientes opuestos estén sanos y disponibles para actuar como el grupo de control saludable.

5. Exposición a la pulpa

1. Utilice la fresa dental para perforar en el lado oclusal del primer molar maxilar a una velocidad de 20.000 rpm. Asegúrese de eliminar el esmalte. Mantenga la operación con la pieza de mano dental solo en la capa poco profunda de la dentina para evitar la estimulación térmica excesiva en el tejido de la pulpa dental¹².
2. Al mismo tiempo, evite el sobrecalentamiento utilizando una jeringa para dejar caer solución salina normal sobre el diente cada 3 minutos durante la operación.
3. Coloque una lima 8# o 10# C+ en la posición más baja de la fosa perforada y perfore la última dentina para exponer la cámara pulpar. Será una sensación evidente de caída cuando la dentina local se extirpe por completo. No profundice demasiado, o el tejido de la pulpa dental podría salir de la cámara pulpar.
4. Limpie los fragmentos alrededor del diente. Quítate la mordaza bucal; La cirugía ha terminado. Utilice el primer molar maxilar opuesto como control sin operación.

6. Cuidados postoperatorios

1. Después de la cirugía, administre carprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea y coloque el ratón en la almohadilla térmica quimiotérmica en posición prona hasta la recuperación de la anestesia. Alimenta a los ratones y dales agua potable. El proceso de recuperación debe ser supervisado. Ningún otro animal debe estar en la misma cámara hasta que el ratón esté completamente recuperado.

7. Recogida y almacenamiento de muestras

1. Sacrificar al ratón con dislocación cervical bajo anestesia profunda 24 horas después de la operación o en cualquier otro momento según el experimento⁹. Corta los músculos del esqueleto unidos al maxilar y al cigoma con unas tijeras oftálmicas. Extirpar el esqueleto, el hueso frontal y el tejido blando y extraer la lámina gnathostegita con molares maxilares.
   NOTA: De acuerdo con He et al., se recomienda que la muestra de pulpitis se recoja menos de 72 horas después de la cirugía para evitar necrosis extensa en el tejido de la pulpa dental¹³.
2. Divida sagitalmente la gnathostegita por la mitad y almacene el tejido en paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7.4, a 4 °C para una fijación de 24 horas.

8. Análisis histológico

1. Lavar los tejidos con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y descalcificarlos en una solución de descalcificación diaria de EDTA al 5% y sacarosa al 4% en PBS, pH 7,4, a 4 °C durante 2-4 semanas¹⁰.
2. Incruste la 1/2 gnathostegita en parafina y asegúrese de que la cara sagital sin dientes esté en la parte inferior de los casetes de tejido.
3. Cortar el bloque de parafina en rodajas de 5 μm de grosor con un micrótomo de parafina. Ajuste el ángulo del bloque de parafina de acuerdo con la relación proximal, distal, superior e inferior observada bajo el microscopio para garantizar que se pueda cortar la pulpa completa de la corona y la perforación del primer molar.

Resultados

El procedimiento descrito anteriormente se realizó en el primer molar maxilar derecho de 3 ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad, mientras que los primeros molares del maxilar izquierdo se conservaron como control. Para la demostración se utilizaron los resultados histológicos y de inmunofluorescencia del control en blanco, las muestras de pulpitis de 12 h y de pulpitis de 24 h.

Siguiendo el protocolo de análisis de TC de Goldman et ^al.15, la exposición pulpar se ...

Discusión

Como tejido blando solitario dentro de los dientes, la pulpa dental cumple un papel crucial en el mantenimiento de la bioactividad del diente, pero sigue siendo muy sensible. La preservación de esta pulpa vital se ha convertido en el enfoque inicial preferido en los tratamientos endodónticos recientes, lo que requiere una comprensión integral de los mecanismos inflamatorios de la pulpa dental¹⁶. La fluctuación espacio-temporal del microambiente inflamatorio y las interacciones entre los tipos ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.