Создание модели воздействия пульпы мыши с новым кляпом для исследования пульпита

Резюме

В данной статье представлен оптимизированный протокол установления модели пульпита у мышей с использованием инновационного ротового кляпа с последующим гистологическим анализом.

Аннотация

Пульпит, распространенная причина естественной потери зубов, приводит к некрозу и потере биологической активности в воспаленной пульпе зуба. Разгадка механизмов, лежащих в основе пульпита, и его эффективное лечение находятся в центре внимания эндодонтических исследований. Таким образом, понимание воспалительного процесса в пульпе зуба жизненно важно для улучшения сохранности пульпы. По сравнению с другими экспериментами in vitro , модель пульпита у мышей предлагает более достоверный и генетически разнообразный контекст для наблюдения за патологическим прогрессированием пульпита. Тем не менее, использование мышей, несмотря на их экономическую эффективность и доступность, создает трудности из-за их небольшого размера, плохой координации и низкой переносимости, что усложняет внутриротовые и стоматологические процедуры. Этот протокол представляет собой новую конструкцию и применение кляпа для обнажения пульпы мыши, способствуя более эффективным внутриротовым процедурам. Кляп, состоящий из зубной дуги, легко доступной для большинства стоматологов, может значительно ускорить хирургическую подготовку даже к первым процедурам. Для выявления изменений морфологии и экспрессии клеток использовали микрокомпьютерную томографию, окрашивание гематоксилин-эозином (ПЭ) и иммунофлуоресцентное окрашивание. Цель данной статьи – помочь исследователям разработать более воспроизводимую и менее сложную процедуру создания модели воспаления пульпы с использованием этого нового кляпа.

Введение

Пульпа зуба, неотъемлемая часть зуба, отвечает за множество важных функций, таких как снабжение питательными веществами, образование дентина, сенсорная функция и защитные реакции¹. Тем не менее, пульпа зуба, окруженная твердыми тканями, подвержена повреждениям и повреждениям в результате глубокого кариеса, пульпита, травмы или последующих методов лечения ^2,3. Отсутствие функциональной пульпы зуба увеличивает риск хрупкости зубов⁴. Кроме того, потеря жизнеспособности пульпы в молодых постоянных зубах может негативно сказаться на созревании зубов, а современные методы протезирования не могут восстановить нервную обратную связь, обеспечиваемую здоровой пульпой⁴. Эта ситуация заставила исследователей изучить альтернативные решения для борьбы с воспаленной пульзой, помимо простого удаления.

В 2007 году Мюррей и др. инициировали применение тканевой инженерии в регенеративной эндодонтии, тем самым вызвав повышенный интерес к сохранению и регенерации пульпы⁵. Тем не менее, воспаленная ткань пульпы представляет собой проблему, поскольку клетки выделяют воспалительные факторы, такие как IL-6, которые рекрутируют воспалительные клетки и приводят к некрозу клеток, потере жизнеспособности пульпы и осложнениям в функциональном восстановлении ^6,7. Таким образом, понимание воспаления и связанной с ним гибели клеток имеет решающее значение для прогресса в сохранении жизненно важной пульпы. Существует ряд экспериментов, которые были проведены для изучения молекулярной биологии воспламененной пульпы in vivo или in vitro ^8,9. Несмотря на то, что эксперименты in vitro, такие как 2D или 3D клеточные культуры, разрабатываются в течение многих лет и становятся все более зрелыми и широко используются для проверки реакций клеток пульпы на воспалительные факторы, эти эксперименты не могут отразить взаимодействие между тканью пульпы и системной^{иммунной системой.} Если изучаемое явление получено из клеток другого тканевого происхождения, таких как иммунная, сосудистая и нервная системы, то культура клеток чистой пульпы приведет к тупику. Поэтому эксперименты in vivo очень нужны и референтны.

Мыши все чаще становятся распространенным выбором в исследованиях воспаления in vivo из-за их экономической эффективности, высокой фертильности и жизнеспособности. Тем не менее, в настоящее время отсутствует комплексный протокол для модели пульпита мышей, который мог бы служить эталоном. Небольшие размеры мышей и их чувствительность к стимуляции создают значительные проблемы во время экспериментальных процедур. Наблюдение за крошечными зубами, скрытыми глубоко во рту мыши, часто требует использования консольного микроскопа, несмотря на более распространенное присутствие настольных микроскопов в лабораториях. Отсутствие открывателя рта требует помощи со стороны окружающих. Чтобы решить эту проблему, группа разработала кляп для рта с использованием легкодоступных материалов, целью которого является обеспечение стандартизированного и воспроизводимого протокола для построения модели пульпита мышей. В этой статье подробно описана процедура, охватывающая предоперационную подготовку, иммобилизацию, операцию по экспозиции пульпы и сбор образцов у мышей C57. Этот протокол рекомендует использовать кляп для рта, предоставляя информацию о его структуре, производстве и применении, чтобы облегчить другим исследователям воспроизведение процедуры.

протокол

Экспериментальные процедуры в этом исследовании были одобрены этическим комитетом Западно-Китайской школы стоматологии Сычуаньского университета (WCHSIRB-D-2021-125). Взрослые мыши C57BL/6 были получены от компании Gempharmatech Experimental Animals Company, Чэнду, Китай. Вся коронка первого моляра верхней челюсти прорезывается через 21 день после рождения. Мыши для операции должны быть старше 21 дня при нормальной жизнеспособности¹¹. Здесь для моделирования использовались мыши в возрасте от 6 до 8 недель. На рисунке 1 показана блок-схема, показывающая используемый протокол.

1. Предоперационная подготовка (Рисунок 2)

1. Приобретите следующие инструменты: Стереоскопический микроскоп, фиксирующую пластину, медицинскую ленту, рот-кляп, малоинвазивный зубной бор диаметром 0,6 мм, стоматологический высокоскоростной стоматологический наконечник, пилку 8#C+, грелку, шприц объемом 1 мл, стерильный ватный тампон, глазные щипцы.
2. Приобретают следующие препараты: смесь для анестезии, ветеринарную мазь.

2. Приготовление рта-кляпа

1. Взвесьте и обезболите мышь путем внутрибрюшинного введения раствора анестезиологической смеси (10% кетамина гидрохлорид + 5% ксилазин + 85% стерильный изотонический раствор) в дозе 0,007 мл/г массы тела и подтвердите надлежащую анестезию методом щипкового пальца ноги. Нанесите на глаза офтальмологическую смазывающую мазь, чтобы предотвратить травмирование глаз из-за высыхания во время операции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимы медицинские шапки, маски, перчатки и комбинезоны, а также другие средства индивидуальной защиты. Убедитесь, что операционная среда и мышиная камера чистые и безопасные. Грелка для термоподдержки на протяжении всей процедуры необходима.
2. Приготовьте кляп для рта, как описано ниже (Рисунок 3).
   1. Приобретите следующие материалы: ортодонтическую дуговую проволоку диаметром 8 мкм, молодые плоскогубцы для изгиба петли, тяжелый кусачок для проволоки, маркер, резиновый колпачок длиной 3 мм и диаметром сечения 1 мм.
   2. Сначала выпрямите арочную проволоку левой рукой для фиксации и большим пальцем, указательный палец правой руки слегка согните против дуги проволоки. Повторите это действие несколько раз, это облегчит изгиб до правильного трехмерного угла.
   3. С помощью плоскогубцев для изгиба петли Йонг согнуть верхний край (Рисунок 3G, a-i) трапеции (Рисунок 3C, a-l-k-b) длиной около 8 мм в средней точке носовой проволоки. Убедитесь, что точка a (рисунок 3) находится на краю клюва плоскогубцев.
   4. Держите плоскогубцы левой рукой, зажмите свободный конец носовой проволоки большим и указательным пальцами правой руки и согните луковую проволоку от точки А под углом около 120°. Продублируйте предыдущее действие в точке i (рисунок 3G). Проверьте, находится ли арочный провод на одной плоскости, положив его на горизонтальный стол без поддевания.
   5. Оставьте около 9 мм длины с каждой стороны (Рисунок 3D, a-b, l-k) и согните свободный конец под углом 75°, используя тот же навык, что и в шаге 2.2.4, при этом следя за тем, чтобы каждый край находился в одной плоскости. Загните этот острый угол кончиком плоскогубца клюва.
   6. Найдите точку c примерно в 5 мм от точки b. Следуйте тому же умению, чтобы согнуть угол 105° в точке c. Согните еще один угол 105° в точке d на 5 мм от точки c. Отойдите примерно на 4,5 мм от точки d и найдите точку e. Согните свободный конец в точке e так, чтобы образовался угол около 100-105° (Рисунок 3E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: У 6-8-недельных мышей C57, которых мы использовали, было около 20 г. Расстояние в 5 мм могло не только заклинивать верхние и нижние челюсти мышей, не двигаясь, но и не давило бы на кожу мышей и не вызывало бы дискомфорта. Если используются мыши других видов или возрастов, пожалуйста, отрегулируйте длину частей c-d и i-h в соответствии с фактической ситуацией (рис. 3E, G).
   7. Согните дополнительный депрессор языка для нижней челюсти (Рисунок 3G, j-i-h-g).
   8. Повторите шаги гибки детали a-b-c на детали l-k-j. Зажмите детали i-k и k-j одновременно и согните свободный конец в точке j, чтобы он стал вертикальным по отношению к плоскости i-k-j. В точке зажима i, которая находится в 5 мм от точки j, согните свободный конец так, чтобы он был параллельен плоскости i-k-j и c-d части (Рисунок 3H).
   9. Оставьте 5 мм длины от точки i, в точке h согните арку вертикально к i-h части и параллельно плоскости j-i-h. Найдите точку g на расстоянии 5 мм от точки h. Зажмите плоскость j-i-h-g и согните свободный конец симметрично k-j части. Тогда свободный конец после точки f должен быть симметричен точке e-свободный конец (рисунок 3H).
   10. Наденьте резиновые колпачки на свободный конец (рисунок 3F).

3. Иммобилизация

1. Зафиксируйте мышь лежа на фиксирующей пластине конечностями, закрепленными кожной лентой. Сожмите свободные концы рта-кляпа большим и указательным пальцами.
2. Зафиксируйте передние резцы мыши в трапециевидной бороздке двух рук. Убедитесь, что рука с депрессором языка предназначена для нижней челюсти. Отрегулируйте кляп для рта, чтобы убедиться, что язык мыши обездвижен, но не ишемичен.

4. Оценка зубов

1. Убедитесь, что первый моляр верхней челюсти для операции не должен иметь кариеса, травм и одонтогенеза. Убедитесь, что на окружающей десне нет покраснения, отека или свища. Убедитесь, что противоположные зубы здоровы и готовы выступать в качестве здоровой контрольной группы.

5. Воздействие пульпы

1. Используйте зубной бор для сверления на окклюзионной стороне первого моляра верхней челюсти со скоростью 20 000 об/мин. Следите за тем, чтобы эмаль была удалена. Проводите операцию с помощью стоматологического наконечника только в неглубоком слое дентина, чтобы предотвратить чрезмерную термическую стимуляцию тканей пульпы зуба¹².
2. В то же время предотвратите перегрев, используя шприц, чтобы капать обычный физиологический раствор на зуб каждые 3 минуты во время операции.
3. Поместите напильник 8# или 10# C+ на самое нижнее место просверленной ямы и проткните последний дентин, чтобы обнажить камеру пульпы. Это будет явное ощущение падения, когда будет тщательно удален местный дентин. Не копайте слишком глубоко, иначе ткань пульпы зуба может быть выведена из пульповой камеры.
4. Очистите фрагменты вокруг зуба. Снимите кляп; Операция завершена. Используйте противоположный первый моляр верхней челюсти в качестве контрольного без операции.

6. Послеоперационный уход

1. После операции введите карпрофен (5 мг/кг) подкожно и поместите мышь на хемотермическую грелку в положении лежа до восстановления после анестезии. Накормите мышей и обеспечьте питьевой водой. Процесс восстановления должен находиться под контролем. Никакие другие животные не должны находиться в той же камере до тех пор, пока мышь полностью не выздоровеет.

7. Сбор и хранение проб

1. Усыпить мышь с вывихом шейки матки под глубокой анестезией через 24 ч после операции или в любой другой момент времени согласно эксперименту⁹. Разрежьте скелетные мышцы, прикрепленные к верхней челюсти и скуловой кости, офтальмологическими ножницами. Удалите скелет, лобную кость и мягкие ткани и удалите гнатостегит пластинки с верхнечелюстными коренными зубами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно He et al., рекомендуется собирать образец пульпита менее чем через 72 ч после операции, чтобы избежать обширного некроза^{в ткани} пульпы зуба.
2. Сагиттально разделите гнатостегит пополам и храните ткань в 4% параформальдегиде в PBS, pH 7,4, при 4 °C в течение 24 часов.

8. Гистологический анализ

1. Промойте ткани фосфатно-солевым буфером (PBS) и декальцифицируйте их в ежедневно меняемом растворе декальцинации 5% ЭДТА и 4% сахарозы в PBS, pH 7,4, при 4 °C в течение 2-4 недель¹⁰.
2. Заделайте 1/2 гнатостегит в парафин и убедитесь, что сагиттальное лицо без зубов находится на дне тканевых кассет.
3. Парафиновый блок нарезать на ломтики толщиной 5 мкм с помощью парафинового микротома. Отрегулируйте угол парафинового блока в соответствии с проксимальным, дистальным, верхним, а также нижним соотношением, наблюдаемым под микроскопом, чтобы обеспечить возможность разрезания всей пульпы коронки и перфорации первого моляра.

Результаты

Описанная выше процедура была выполнена на первом моляре правой верхней челюсти у 3 мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель, при этом первые моляры левой верхней челюсти были сохранены в качестве контроля. Для демонстрации были использованы результаты гистологии и иммунофлюоресценции холостог...

Обсуждение

Являясь единственной мягкой тканью в зубах, пульпа зуба выполняет решающую роль в поддержании биологической активности зуба, но при этом остается высокочувствительной. Сохранение этой жизненно важной пульпы стало предпочтительным начальным подходом в современных эндодонтических ме...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.