التقييم الميكروبيولوجي السريع في الموقع للأمراض المعدية الرئوية

Summary

يوضح البروتوكول هنا سير عمل سريع وموحد للتقييم الميكروبيولوجي السريع في الموقع (M-ROSE) ، بما في ذلك ثلاث خطوات: صنع الشرائح ، والتلوين ، والتفسير. سيساعد هذا البروتوكول الأطباء على اتخاذ قرارات سريرية سريعة.

Abstract

يعد البدء الفوري للعلاج التجريبي المضاد للعدوى أمرا بالغ الأهمية في المرضى الذين يعانون من عدوى رئوية غير مبررة. على الرغم من أن الحصول على التصوير بسيط نسبيا في الممارسة السريرية ، إلا أن افتقاره إلى الخصوصية غالبا ما يتطلب اختبارات إضافية تستغرق وقتا طويلا مثل ثقافة البلغم أو ثقافة سائل غسل القصبات الهوائية أو التسلسل الجيني لتحديد المسببات الأساسية للمرض بدقة. علاوة على ذلك ، قد تساهم الفعالية المحدودة للعلاج التجريبي المضاد للعدوى في إساءة استخدام المضادات الحيوية. مكنت التطورات الحديثة في تفسير الخلفية الميكروبية في شرائح التقييم السريع في الموقع (ROSE) الأطباء من الحصول على عينات على الفور من خلال تنظير القصبات (على سبيل المثال ، غسل السنخية ، وتنظيف الغشاء المخاطي بالفرشاة ، ومشبك الأنسجة) ، مما يسهل تلطيخ السرير والتفسير الذي يوفر معلومات أساسية عن الخلفية الميكروبية. وبالتالي ، فإن هذا يضع أساسا لتطوير العلاج المستهدف المضاد للعدوى وخطط العلاج الدوائي الفردية. من خلال فهم أفضل لمسببات الأمراض التي تسبب العدوى في الوقت الفعلي ، يمكن للأطباء تجنب المضادات الحيوية واسعة الطيف غير الضرورية التي تساهم في مقاومة المضادات الحيوية. إن إنشاء سير عمل سريع وموحد ل M-ROSE داخل أقسام طب الجهاز التنفسي أو وحدات العناية المركزة سيساعد الأطباء بشكل كبير في صياغة استراتيجيات علاج دقيقة للمرضى ، والتي لها آثار سريرية كبيرة.

Introduction

تقنية التقييم السريع في الموقع (ROSE) هي طريقة عالية الكفاءة تستخدم في مجال إجراءات أمراض الرئة. إنه يتيح أخذ العينات في الوقت الفعلي والتدخل التشخيصي ، مما يسهل التحليل الخلوي الفوري¹. يتضمن هذا النهج المبتكر طباعة جزء من عينة الأنسجة على شريحة مع الحفاظ على سلامتها. تكمن إحدى المزايا الرئيسية ل ROSE في قدرتها على تسهيل التفسير الفوري للمعلومات السريرية من خلال تقنيات الفحص المجهري المتخصصة. وهذا يشمل تحليل مورفولوجيا الخلية ، والتصنيف ، والقياس الكمي ، وتحديد النسب المكونة ، وتقييم الترتيب ، وتحليل الارتباط ، وتقييم الخلفية ، وتحديد الأجسام الغريبة. من خلال دمج كل هذه البيانات مع المعلومات السريرية للمريض ، تلعب ROSE دورا محوريا في تقييم كفاية أخذ العينات وتوجيه الإجراءات والتقنيات التدخلية في الوقت الفعلي².

كشركة تابعة لتقنية ROSE ، تركز تقنية M-ROSE بشكل أساسي على اكتساب الخلفية الميكروبيولوجية للآفات المستهدفة بدلا من التمييز بين الخلايا الحميدة والخبيثة ^3,4. من ناحية ، يتيح M-ROSE التحديد المجهري لمسببات الأمراض مثل Aspergillus و Cryptococcus و Pneumocystis و Candida⁵. من ناحية أخرى ، فإنه يحمل آثارا إرشادية كبيرة في تقييم جودة عينات الجهاز التنفسي ، والتمييز بين الأمراض المعدية وغير المعدية ، والتمييز بين العدوى والتلوث ، وكذلك تقييم شدة العدوى والتشخيص ^6,7. على سبيل المثال ، داخل عينة الجهاز التنفسي ، يشير تعايش البكتيريا التي تظهر مورفولوجيا متطابقة جنبا إلى جنب مع الخلايا الالتهابية المتسللة إلى وجود عدوى. على العكس من ذلك ، فإن وجود بكتيريا متعددة متنوعة شكليا مصحوبة بخلايا ظهارية يشير إلى التلوث. إن القدرة على التحليل الشامل للمعلومات السريرية والتنبؤ بالنتائج تجعل M-ROSE أداة لا تقدر بثمن في إجراءات أمراض الرئة.

في الختام ، يعمل ROSE كناقل خلوي حاسم يعزز بشكل كبير كفاءة ودقة تشخيص أمراض الرئة. تساهم قدراتها متعددة الأوجه في تحسين نتائج المرضى من خلال ضمان التدخل في الوقت المناسب وتسهيل التشخيص الدقيق من خلال أخذ العينات في الوقت الفعلي وتقنيات التدخل التشخيصي. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذه التطورات تعتمد على الحصول على عينات مؤهلة. هنا ، نقدم بروتوكول M-ROSE موحدا يشمل تحضير الشرائح وتقنيات التلوين وإرشادات التفسير. يعمل هذا البروتوكول كمرجع لا يقدر بثمن للأطباء لوضع خطط تقييم وعلاج دقيقة مع تسهيل اتخاذ القرار فيما يتعلق بالتعامل اللاحق مع العينات المستهدفة.

Protocol

تمت الموافقة على التجربة السريرية من قبل لجنة الموافقة في مستشفى تشونغتشينغ للطب الصيني التقليدي (رقم 2022-ky-31). تضمنت الحالة النموذجية مريضا تم تشخيصه بالالتهاب الرئوي المتكيسة الرئوية ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من المريض.

1. متطلبات المعدات والمواد ل ROSE

1. المعدات: راجع ملف جدول المواد للمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
   ملاحظة: من الضروري استخدام مجهر خلوي مخصص ونظام تصوير رسومي (الشكل 1 أ).
2. إعداد المواد (انظر جدول المواد).
   1. قم بإعداد شرائح زراعة الخلايا المعقمة (مع التصاق قوي للخلايا) ، وورق ماص ، وقفازات لاتكس خالية من المسحوق ، وإبر حقنة يمكن التخلص منها سعة 2.5-5 مل ، وضع المجموعة الكاملة من محاليل تلطيخ Diff Quik (DQ) في مرطبانات تلطيخ زجاجية بأغطية محكمة الغلق لسهولة التعامل (الشكل 1).

2. سير عمل M-ROSE

1. إعداد الشرائح الخلوية
   ملاحظة: هناك العديد من الطرق لإعداد الشرائح، وفيما يلي العديد من طرق التحضير شائعة الاستخدام.
   1. لفة الشرائح
      ملاحظة: تأكد من الحد الأدنى من فقدان عينة الأنسجة أثناء هذه العملية.
      1. استخراج جزيئات الأنسجة باستخدام إبرة حقنة يمكن التخلص منها بسعة 2.5-5 مل (الشكل 2 أ).
      2. انشر منطقة دائرية ، قطرها حوالي 1 سم وذات سمك معتدل ، من الجزء الداخلي إلى الجزء الخارجي من الطرف الملون (النهاية تظهر ارتباطا قويا بالخلية) على شريحة علم الخلايا المعقمة.
   2. شرائح الفرشاة
      ملاحظة: تنطبق هذه الطريقة على العينات التي تم الحصول عليها باستخدام فرش الخلايا التقليدية أو فرش الخلايا المضادة للتلوث أو فرش الخلايا متناهية الصغر ، وكذلك العينات شبه السائلة مثل البلغم وسوائل الجسم اللزجة.
      1. قم بتمديد رأس الفرشاة وتطبيقه على الثلث البعيد من الشريحة الزجاجية الخلوية المعقمة (تتميز الشريحة بخصائص التصاق قوية للخلايا) للحصول على مساحة مستطيلة تبلغ حوالي 2 سم × 1 سم بسمك معتدل.
   3. رش الشرائح
      1. ضع إبرة البزل في ثلث الطرف الملطخ لشريحة علم الخلايا المعقمة مع التصاق قوي للخلايا.
      2. ضع ضغط الهواء على طرف إبرة الثقب وأدخله من الجانب الداخلي للخارج ، لتشكيل منطقة دائرية بسمك متوسط يبلغ قطره حوالي 1 سم.
2. تلطيخ الشريحة الخلوية
   ملاحظة: توصي منظمة الصحة العالمية (WHO) بالتلوين السريع لشريحة ROSE الخلوية باستخدام صبغة Diff⁵. يمكن إعادة استخدام صبغة Diff ولكن لا تتكرر عدة مرات. إذا كان هناك رواسب ، فيجب ترشيحها بعد الاستخدام. يمكن إزالة لون الصباغة العميقة جدا بشكل صحيح بواسطة الميثانول أو الكحول ، ويفضل ألا تكون مصبوغة. إذا كانت الصباغة عميقة جدا أو ضحلة جدا ، فيجب ضبط وقت الصباغة أو تركيز سائل العمل ؛ قيمة الرقم الهيدروجيني لها تأثير معين على الصباغة ، ويجب أن تكون الشريحة نظيفة وخالية من التلوث الحمضي والقلوي. كل من محلول الفرق أ ومحلول الفرق ب متقلبان ويجب إغلاقهما وتخزينهما بعد الاستخدام.
   1. اغمر الشريحة في محلول الفرق A لمدة 10-30 ثانية (الشكل 2 ب) ، ثم اشطفها في حمام صبغة PBS لإزالة محلول Diff A الزائد وتخلص برفق من أي مخزن مؤقت متبقي (الشكل 2C).
   2. بعد ذلك ، اغمر الشريحة في محلول Diff B لمدة 20-40 ثانية (الشكل 2E).
   3. أخيرا ، قم بتنظيف الشريحة في خزان صباغة المياه (الشكل 2F) ، وصمة عار ومسح السائل المتبقي من الشريحة بورق ماص (الشكل 2D) ، وإنهاء الصباغة.
      ملاحظة: يتيح M-ROSE التصور المباشر للكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض ويسهل تقييم جودة عينة الجهاز التنفسي ، مما يتيح التمييز بين العدوى وغير العدوى وكذلك العدوى والتلوث ، والتي لها أهمية توجيهية لتقييم شدة العدوى والتشخيص. سيغطي قسم المناقشة هذا الجانب لأنه لا يتضمن أي إجراءات تجريبية.

النتائج

في حالة نموذجية ، قدم رجل يبلغ من العمر 63 عاما إلى المستشفى مصابا بسعال وحمى وألم في الصدر. تم تشخيص المريض سابقا بالمتلازمة الكلوية ، التي تتميز بالبيلة البروتينية والوذمة ، وتلقى العلاج مع بريدنيزون وتاكروليموس لفترة طويلة. أظهرت النتائج المختبرية الأولية أن عدد خلايا الدم البيضاء يبلغ...

Discussion

أمراض الرئة التداخلية هي فرع قيم من أمراض الجهاز التنفسي الحديثة. على وجه الخصوص ، تم استخدامه على نطاق واسع في تشخيص أمراض الرئة ^8,9. في السنوات الأخيرة ، ازدهر طب الرئة التدخلي التشخيصي بسبب زيادة انتشار الأورام الخبيثة الرئوية ، والمزيد من عدوى مسببات الأ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101