Mikrobiologische Vor-Ort-Schnellbewertung für pulmonale Infektionskrankheiten

Zusammenfassung

Das Protokoll demonstriert einen schnellen und standardisierten Arbeitsablauf für die mikrobiologische Vor-Ort-Bewertung (M-ROSE), der drei Schritte umfasst: Herstellung von Objektträgern, Färbung und Interpretation. Dieses Protokoll wird Ärzten helfen, schnelle klinische Entscheidungen zu treffen.

Zusammenfassung

Die unverzügliche Einleitung einer empirischen antiinfektiven Therapie ist bei Patienten mit ungeklärten Lungeninfektionen von entscheidender Bedeutung. Obwohl die Bildgebung in der klinischen Praxis relativ einfach ist, erfordert ihre mangelnde Spezifität oft zusätzliche zeitaufwändige Tests wie Sputumkultur, bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeitskultur oder genetische Sequenzierung, um die zugrunde liegende Ätiologie der Krankheit genau zu identifizieren. Darüber hinaus kann die begrenzte Wirksamkeit der empirischen antiinfektiven Behandlung zum Antibiotikamissbrauch beitragen. Jüngste Fortschritte bei der Interpretation des mikrobiellen Hintergrunds auf ROSE-Objektträgern (Rapid On-Site Evaluation) haben es Klinikern ermöglicht, Proben umgehend durch Bronchoskopie zu entnehmen (z. B. Alveolarspülung, Schleimhautbürsten, Gewebeklemmung), was die Färbung und Interpretation am Krankenbett erleichtert, die wichtige mikrobielle Hintergrundinformationen liefert. Damit wird die Grundlage für die Entwicklung gezielter antiinfektiöser Therapien und individualisierter medikamentöser Therapiepläne geschaffen. Mit einem besseren Verständnis dafür, welche Krankheitserreger in Echtzeit Infektionen verursachen, können Ärzte unnötige Breitbandantibiotika vermeiden, die zur Antibiotikaresistenz beitragen. Die Etablierung eines schnellen und standardisierten M-ROSE-Arbeitsablaufs in den Abteilungen der Beatmungsmedizin oder auf den Intensivstationen wird den Ärzten bei der Formulierung präziser Behandlungsstrategien für Patienten helfen, was erhebliche klinische Auswirkungen hat.

Einleitung

Die Technik der schnellen Vor-Ort-Evaluierung (ROSE) ist eine hocheffiziente Methode, die im Bereich der Lungenerkrankung eingesetzt wird. Es ermöglicht Echtzeit-Probenahmen und diagnostische Eingriffe und ermöglicht so eine sofortige zytologische Analyse¹. Bei diesem innovativen Ansatz wird ein Teil der Gewebeprobe auf einen Objektträger geprägt, während seine Integrität erhalten bleibt. Einer der Hauptvorteile von ROSE liegt in seiner Fähigkeit, eine schnelle Interpretation klinischer Informationen durch spezialisierte Mikroskopietechniken zu ermöglichen. Dies umfasst die Analyse der Zellmorphologie, die Klassifikation, Quantifizierung, Bestimmung der Verhältnisse der Bestandteile, die Beurteilung der Anordnung, die Korrelationsanalyse, die Bewertung des Hintergrunds und die Identifizierung von Fremdkörpern. Durch die Integration all dieser Daten mit den klinischen Informationen des Patienten spielt ROSE eine entscheidende Rolle bei der Bewertung der Angemessenheit der Probenahme und der Steuerung von Interventionsverfahren und -techniken^{in Echtzeit 2}.

Als Tochterunternehmen der ROSE-Technologie konzentriert sich die M-ROSE-Technologie in erster Linie auf die Erfassung des mikrobiologischen Hintergrunds von Zielläsionen und nicht auf die Unterscheidung zwischen gutartigen und bösartigen Zellen ^3,4. Einerseits ermöglicht M-ROSE die mikroskopische Identifizierung von Krankheitserregern wie Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis und Candida⁵. Auf der anderen Seite hat sie erhebliche Auswirkungen auf die Bewertung der Qualität von Atemwegsproben, die Unterscheidung zwischen infektiösen und nicht-infektiösen Krankheiten, die Unterscheidung von Infektionen und Kontaminationen sowie die Bewertung des Schweregrads und der Prognose der Infektion ^6,7. So deutet beispielsweise die Koexistenz von Bakterien, die eine identische Morphologie aufweisen, neben infiltrierenden Entzündungszellen in einer Atemwegsprobe auf eine Infektion hin; Umgekehrt deutet das Vorhandensein mehrerer morphologisch unterschiedlicher Bakterien, die von Epithelzellen begleitet werden, auf eine Kontamination hin. Die Fähigkeit, klinische Informationen umfassend zu analysieren und Ergebnisse vorherzusagen, macht M-ROSE zu einem unschätzbaren Werkzeug bei der Behandlung von Lungenerkrankungen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ROSE als wichtiger zytologischer Träger dient, der die Effizienz und Präzision der Diagnose von Lungenerkrankungen erheblich verbessert. Seine vielseitigen Funktionen tragen zu verbesserten Patientenergebnissen bei, indem sie ein rechtzeitiges Eingreifen gewährleisten und eine genaue Diagnose durch Echtzeit-Probenahmen und diagnostische Interventionstechniken ermöglichen. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Fortschritte auf der Gewinnung qualifizierter Proben beruhen. Darin stellen wir ein standardisiertes M-ROSE-Protokoll vor, das die Vorbereitung des Objektträgers, Färbetechniken und Interpretationsrichtlinien umfasst. Dieses Protokoll dient als unschätzbare Referenz für Kliniker, um genaue Bewertungs- und Behandlungspläne zu erstellen und gleichzeitig die Entscheidungsfindung hinsichtlich der anschließenden Handhabung von Zielproben zu erleichtern.

Protokoll

Die klinische Studie wurde vom Zulassungsausschuss des Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine genehmigt (Nr. 2022-ky-31). Der typische Fall betraf einen Patienten, bei dem eine Pneumocystis-Pneumonie diagnostiziert wurde, und es wurde eine Einverständniserklärung des Patienten eingeholt.

1. Ausrüstungs- und Materialanforderungen für ROSE

1. Ausrüstung: In der Datei "Table of Materials " finden Sie die in diesem Protokoll verwendeten Geräte.
   HINWEIS: Die Verwendung eines speziellen zytologischen Mikroskops und eines grafischen Bildgebungssystems ist zwingend erforderlich (Abbildung 1A).
2. Materialvorbereitung (siehe Materialtabelle).
   1. Bereiten Sie sterile Zellkultur-Objektträger (mit starker Zelladhäsion), saugfähiges Papier, puderfreie Latexhandschuhe, Einweg-Spritzennadeln von 2,5 bis 5 ml vor und geben Sie den kompletten Satz Diff Quik (DQ) Färbelösungen in Glasfärbegläser mit versiegelten Deckeln, um eine einfache Handhabung zu ermöglichen (Abbildung 1).

2. M-ROSE-Arbeitsablauf

1. Vorbereitung von zytologischen Objektträgern
   HINWEIS: Es gibt viele Möglichkeiten, Folien vorzubereiten, und im Folgenden sind einige häufig verwendete Vorbereitungsmethoden aufgeführt.
   1. Rollen-Rutschen
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass während dieses Prozesses nur ein minimaler Verlust von Gewebeproben auftritt.
      1. Extrahieren Sie Gewebepartikel mit einer Einwegspritzennadel mit einem Fassungsvermögen von 2,5-5 mL (Abbildung 2A).
      2. Verteilen Sie eine kreisförmige Fläche von etwa 1 cm Durchmesser und mäßiger Dicke vom inneren zum äußeren Drittel des gefärbten Endes (das Ende mit starker Zellanhaftung) auf dem sterilen Zytologie-Objektträger.
   2. Pinsel-Folien
      HINWEIS: Diese Methode ist anwendbar auf Proben, die mit herkömmlichen Zellbürsten, Anti-Pollution-Zellbürsten oder ultrafeinen Zellbürsten gewonnen wurden, sowie auf halbflüssige Proben wie Sputum und viskose Körperflüssigkeiten.
      1. Verlängern Sie den Bürstenkopf und tragen Sie ihn auf das distale Drittel des sterilen zytologischen Glasobjektträgers auf (der Objektträger hat starke Zelladhäsionseigenschaften), um eine rechteckige Fläche von etwa 2 cm x 1 cm mit einer moderaten Dicke zu erhalten.
   3. Spray-Objektträger
      1. Positionieren Sie die Punktionsnadel an einem Drittel des gefärbten Endes eines sterilen Zytologie-Objektträgers mit robuster Zelladhäsion.
      2. Üben Sie Luftdruck auf die Spitze der Stechnadel aus und führen Sie sie von der Innenseite nach außen ein, so dass eine kreisförmige Fläche mit mittlerer Dicke von ca. 1 cm Durchmesser entsteht.
2. Zytologische Objektträgerfärbung
   HINWEIS: Die Weltgesundheitsorganisation (WHO) empfiehlt eine schnelle Färbung des zytologischen Objektträgers ROSE mit dem Farbstoff⁵ von Diff. Der Diff-Farbstoff kann wiederverwendet, aber nicht viele Male wiederholt werden. Wenn Ablagerungen vorhanden sind, sollten diese nach Gebrauch gefiltert werden. Zu tiefes Färben kann durch Methanol oder Alkohol ordentlich entfärbt werden, am besten nicht mehr gefärbt. Wenn das Färben zu tief oder zu flach ist, sollte die Färbezeit oder die Konzentration der Arbeitsflüssigkeit angepasst werden; Der pH-Wert hat einen gewissen Einfluss auf das Färben, und der Objektträger sollte sauber und frei von Säure- und Laugenbelastungen sein. Sowohl die Diff A-Lösung als auch die Diff B-Lösung sind flüchtig und sollten nach Gebrauch versiegelt und gelagert werden.
   1. Tauchen Sie den Objektträger 10-30 s lang in Diff A-Lösung (Abbildung 2B), spülen Sie ihn dann im PBS-Färbebad ab, um überschüssige Diff A-Lösung zu entfernen, und schütteln Sie den verbleibenden Puffer vorsichtig ab (Abbildung 2C).
   2. Tauchen Sie die Folie anschließend 20 bis 40 s lang in die Diff B-Lösung (Abbildung 2E).
   3. Reinigen Sie abschließend den Objektträger im Wasserfärbetank (Abbildung 2F), tupfen und wischen Sie die Restflüssigkeit des Objektträgers mit saugfähigem Papier ab (Abbildung 2D) und färben Sie ihn fertig.
      HINWEIS: M-ROSE ermöglicht die direkte Visualisierung pathogener Mikroorganismen und erleichtert die Beurteilung der Qualität von Atemwegsproben, wodurch die Unterscheidung zwischen Infektion und Nichtinfektion sowie Infektion und Kontamination ermöglicht wird, was für die Bewertung des Schweregrads und der Prognose der Infektion von entscheidender Bedeutung ist. Der Diskussionsteil wird diesen Aspekt behandeln, da es sich nicht um experimentelle Verfahren handelt.

Ergebnisse

In einem typischen Fall kam ein 63-jähriger Mann mit Husten, Fieber und Schmerzen in der Brust ins Krankenhaus. Bei dem Patienten wurde zuvor ein nephrotisches Syndrom diagnostiziert, das durch Proteinurie und Ödeme gekennzeichnet ist, und er wurde lange Zeit mit Prednison und Tacrolimus behandelt. Die ersten Laborbefunde zeigten eine Anzahl weißer Blutkörperchen von 10,49 x 10⁹/L, eine Neutrophilenzahl von 8,87 x 10⁹/L, ein C-reaktives Vollblutprotein und (1-3)-β-D-Glucan-Konzentrationen von 1...

Diskussion

Die interventionelle Pneumologie ist ein wertvoller Zweig der modernen Atemwegserkrankungen. Insbesondere wurde es häufig bei der Diagnose von Lungenerkrankungen eingesetzt ^8,9. In den letzten Jahren hat die diagnostische interventionelle Pneumologie aufgrund der zunehmenden Prävalenz von pulmonalen bösartigen Tumoren, der zunehmenden arzneimittelresistenten Erregerinfektionen in den unteren Atemwegen und der Forderung nach Diagnosen von rätselhaften und krit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101