Évaluation microbiologique rapide sur site des maladies infectieuses pulmonaires

Résumé

Le protocole ici présente un flux de travail rapide et standardisé d’évaluation microbiologique rapide sur site (M-ROSE), comprenant trois étapes : la fabrication des lames, la coloration et l’interprétation. Ce protocole aidera les médecins à prendre des décisions cliniques rapides.

Résumé

L’instauration rapide d’un traitement anti-infectieux empirique est cruciale chez les patients présentant une infection pulmonaire inexpliquée. Bien que l’acquisition d’imagerie soit relativement simple dans la pratique clinique, son manque de spécificité nécessite souvent des tests supplémentaires chronophages tels que la culture d’expectorations, la culture de liquide de lavage broncho-alvéolaire ou le séquençage génétique pour identifier avec précision l’étiologie sous-jacente de la maladie. De plus, l’efficacité limitée d’un traitement anti-infectieux empirique peut contribuer à l’utilisation abusive d’antibiotiques. Les progrès récents dans l’interprétation du fond microbien sur les lames d’évaluation rapide sur site (ROSE) ont permis aux cliniciens d’obtenir rapidement des échantillons par bronchoscopie (par exemple, lavage alvéolaire, brossage de la muqueuse, pince tissulaire), facilitant la coloration au chevet du patient et l’interprétation qui fournit des informations essentielles sur le fond microbien. Par conséquent, cela constitue une base pour l’élaboration d’un traitement anti-infectieux ciblé et de plans de traitement médicamenteux individualisés. Grâce à une meilleure compréhension en temps réel des agents pathogènes à l’origine des infections, les médecins peuvent éviter les antibiotiques à large spectre inutiles qui contribuent à la résistance aux antibiotiques. La mise en place d’un flux de travail M-ROSE rapide et standardisé au sein des services de médecine respiratoire ou des unités de soins intensifs aidera grandement les médecins à formuler des stratégies de traitement précises pour les patients, ce qui a des implications cliniques importantes.

Introduction

La technique d’évaluation rapide sur site (ROSE) est une méthode très efficace utilisée dans le domaine des procédures de maladies pulmonaires. Il permet un prélèvement en temps réel et une intervention diagnostique, facilitant ainsi une analyse cytologique immédiate¹. Cette approche innovante consiste à imprimer une partie de l’échantillon de tissu sur une lame tout en préservant son intégrité. L’un des principaux avantages de ROSE réside dans sa capacité à faciliter l’interprétation rapide des informations cliniques grâce à des techniques de microscopie spécialisées. Cela comprend l’analyse de la morphologie cellulaire, la classification, la quantification, la détermination des rapports de constituants, l’évaluation de l’arrangement, l’analyse de corrélation, l’évaluation du bruit de fond et l’identification des corps étrangers. En intégrant toutes ces données aux informations cliniques du patient, ROSE joue un rôle central dans l’évaluation de l’adéquation de l’échantillonnage et l’orientation des procédures et techniques d’intervention en temps réel².

En tant que filiale de ROSE technology, la technologie M-ROSE se concentre principalement sur l’acquisition du fond microbiologique des lésions cibles plutôt que sur la distinction entre les cellules bénignes et malignes ^3,4. D’une part, M-ROSE permet l’identification microscopique d’agents pathogènes tels que Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis et Candida⁵. D’autre part, il a des implications importantes pour évaluer la qualité des échantillons respiratoires, distinguer les maladies infectieuses des maladies non infectieuses, distinguer l’infection de la contamination, ainsi que l’évaluation de la gravité et du pronostic de l’infection ^6,7. Par exemple, au sein d’un échantillon respiratoire, la coexistence de bactéries présentant une morphologie identique avec des cellules inflammatoires infiltrantes indique une infection ; À l’inverse, la présence de plusieurs bactéries morphologiquement diverses accompagnées de cellules épithéliales suggère une contamination. La capacité d’analyser de manière exhaustive les informations cliniques et de prédire les résultats fait de M-ROSE un outil inestimable dans les procédures de maladies pulmonaires.

En conclusion, ROSE sert de vecteur cytologique crucial qui améliore considérablement l’efficacité et la précision du diagnostic des maladies pulmonaires. Ses capacités multidimensionnelles contribuent à améliorer les résultats pour les patients en assurant une intervention rapide et en facilitant un diagnostic précis grâce à des techniques d’échantillonnage et d’intervention diagnostique en temps réel. Cependant, il est important de noter que ces avancées reposent sur l’obtention d’échantillons qualifiés. Nous présentons ici un protocole M-ROSE standardisé englobant la préparation des lames, les techniques de coloration et les directives d’interprétation. Ce protocole sert de référence inestimable aux cliniciens pour établir des plans d’évaluation et de traitement précis tout en facilitant la prise de décision concernant la manipulation ultérieure des échantillons cibles.

Protocole

L’essai clinique a été approuvé par le Comité d’approbation de l’Hôpital de médecine traditionnelle chinoise de Chongqing (n° 2022-KY-31). Le cas typique impliquait un patient diagnostiqué avec une pneumonie à Pneumocystis, et le consentement éclairé a été obtenu du patient.

1. Exigences en matière d’équipement et de matériel pour ROSE

1. Équipement : Reportez-vous au fichier de la Table des matériaux pour connaître l’équipement utilisé dans ce protocole.
   REMARQUE : L’utilisation d’un microscope cytologique et d’un système d’imagerie graphique dédiés est impérative (Figure 1A).
2. Préparation des matériaux (voir tableau des matériaux).
   1. Préparez des lames de culture cellulaire stériles (avec une forte adhérence cellulaire), du papier absorbant, des gants en latex non poudrés, des aiguilles de seringue jetables de 2,5 à 5 ml et placez l’ensemble complet des solutions de coloration Diff Quik (DQ) dans des bocaux en verre avec des couvercles scellés pour une manipulation facile (Figure 1).

2. Flux de travail M-ROSE

1. Préparation de lames cytologiques
   REMARQUE : Il existe de nombreuses façons de préparer des diapositives, et voici plusieurs méthodes de préparation couramment utilisées.
   1. Toboggans roulants
      REMARQUE : Assurez-vous d’une perte minimale d’échantillon de tissu pendant ce processus.
      1. Extraire les particules de tissu à l’aide d’une aiguille de seringue jetable d’une capacité de 2,5 à 5 ml (figure 2A).
      2. Étalez une zone circulaire, d’environ 1 cm de diamètre et d’épaisseur modérée, de l’intérieur vers l’extérieur d’un tiers de l’extrémité colorée (l’extrémité présentant une forte attache cellulaire) sur la lame de cytologie stérile.
   2. Lames de brosse
      REMARQUE : Cette méthode s’applique aux échantillons obtenus à l’aide de brosses cellulaires conventionnelles, de brosses cellulaires antipollution ou de brosses cellulaires ultrafines, ainsi qu’aux échantillons semi-liquides tels que les expectorations et les fluides corporels visqueux.
      1. Étendez la tête de brosse et appliquez-la sur le tiers distal de la lame de verre cytologique stérile (la lame a de fortes propriétés d’adhérence cellulaire) pour obtenir une zone rectangulaire d’environ 2 cm x 1 cm avec une épaisseur modérée.
   3. Lames de pulvérisation
      1. Positionnez l’aiguille de ponction à un tiers de l’extrémité colorée d’une lame de cytologie stérile avec une adhérence cellulaire robuste.
      2. Appliquez une pression d’air sur la pointe de l’aiguille de piercing et insérez-la de l’intérieur vers l’extérieur, formant une zone circulaire d’épaisseur moyenne mesurant environ 1 cm de diamètre.
2. Coloration des lames cytologiques
   REMARQUE : L’Organisation mondiale de la santé (OMS) recommande une coloration rapide de la lame cytologique ROSE à l’aide du colorant⁵ de Diff. Le colorant Diff peut être réutilisé mais pas répété plusieurs fois. S’il y a des sédiments, ils doivent être filtrés après utilisation. Une teinture trop profonde peut être correctement décolorée par du méthanol ou de l’alcool, de préférence ne plus être teinte. Si la teinture est trop profonde ou trop peu profonde, le temps de teinture ou la concentration de liquide de travail doit être ajusté ; la valeur du pH a une certaine influence sur la teinture, et la lame doit être propre et exempte de pollution acide et alcaline. Les solutions de diff A et de diff B sont volatiles et doivent être scellées et stockées après utilisation.
   1. Immergez la lame dans la solution de Diff A pendant 10 à 30 s (Figure 2B), puis rincez-la dans le bain de colorant PBS pour éliminer l’excès de solution de Diff A et secouez doucement tout tampon restant (Figure 2C).
   2. Ensuite, immergez la lame dans la solution de différentiel B pendant 20 à 40 s (Figure 2E).
   3. Enfin, nettoyez la lame dans le réservoir de teinture à l’eau (Figure 2F), épongez et essuyez le liquide résiduel de la lame avec du papier absorbant (Figure 2D) et terminez la teinture.
      REMARQUE : M-ROSE permet de visualiser directement les micro-organismes pathogènes et facilite l’évaluation de la qualité des échantillons respiratoires, ce qui permet de distinguer l’infection de la non-infection ainsi que l’infection et la contamination, ce qui a une importance déterminante pour l’évaluation de la gravité et du pronostic de l’infection. La section de discussion couvrira cet aspect car il n’implique aucune procédure expérimentale.

Résultats

Dans un cas typique, un homme de 63 ans s’est présenté à l’hôpital avec une toux, de la fièvre et des douleurs thoraciques. Le patient avait déjà été diagnostiqué avec un syndrome néphrotique, caractérisé par une protéinurie et un œdème, et a reçu un traitement à base de prednisone et de tacrolimus pendant une longue période. Les premiers résultats de laboratoire ont révélé une numération des globules blancs de 10,49 x 10⁹/L, une numération des neutrophiles de 8,87 x 10⁹...

Discussion

La pneumologie interventionnelle est une branche précieuse des maladies respiratoires modernes ; En particulier, il a été largement utilisé dans le diagnostic des maladies pulmonaires ^8,9. Ces dernières années, la pneumologie interventionnelle diagnostique a prospéré en raison de la prévalence accrue des tumeurs malignes pulmonaires, de l’augmentation du nombre d’infections pathogènes résistantes aux médicaments dans les voies respiratoires infé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101