Avaliação microbiológica rápida no local para doenças infecciosas pulmonares

Resumo

O protocolo aqui demonstra um fluxo de trabalho rápido de avaliação microbiológica rápida no local (M-ROSE) rápido e padronizado, incluindo três etapas: confecção de lâminas, coloração e interpretação. Este protocolo ajudará os médicos a tomar decisões clínicas rápidas.

Resumo

O início imediato da terapia anti-infecciosa empírica é crucial em pacientes que apresentam infecção pulmonar inexplicada. Embora a aquisição de imagens seja relativamente simples na prática clínica, sua falta de especificidade geralmente requer testes adicionais demorados, como cultura de escarro, cultura de fluido de lavagem broncoalveolar ou sequenciamento genético para identificar a etiologia subjacente da doença com precisão. Além disso, a eficácia limitada do tratamento anti-infeccioso empírico pode contribuir para o uso indevido de antibióticos. Avanços recentes na interpretação do histórico microbiano em lâminas de avaliação rápida no local (ROSE) permitiram que os médicos obtivessem amostras prontamente por meio de broncoscopia (por exemplo, lavagem alveolar, escovação da mucosa, pinça de tecido), facilitando a coloração e a interpretação à beira do leito que fornece informações essenciais sobre o histórico microbiano. Consequentemente, isso estabelece uma base para o desenvolvimento de tratamento anti-infeccioso direcionado e planos individualizados de terapia medicamentosa. Com uma melhor compreensão de quais patógenos estão causando infecções em tempo real, os médicos podem evitar antibióticos desnecessários de amplo espectro que contribuem para a resistência aos antibióticos. O estabelecimento de um fluxo de trabalho M-ROSE rápido e padronizado nos departamentos de medicina respiratória ou unidades de terapia intensiva ajudará muito os médicos a formular estratégias de tratamento precisas para os pacientes, o que tem implicações clínicas significativas.

Introdução

A técnica de avaliação rápida no local (ROSE) é um método altamente eficiente empregado no campo dos procedimentos de doenças pulmonares. Permite amostragem em tempo real e intervenção diagnóstica, facilitando a análise citológica imediata¹. Essa abordagem inovadora envolve a impressão de uma parte da amostra de tecido em uma lâmina, preservando sua integridade. Uma das principais vantagens do ROSE reside em sua capacidade de facilitar a interpretação imediata das informações clínicas por meio de técnicas especializadas de microscopia. Isso abrange a análise da morfologia celular, classificação, quantificação, determinação de proporções constituintes, avaliação de arranjo, análise de correlação, avaliação de fundo e identificação de objetos estranhos. Ao integrar todos esses dados com as informações clínicas do paciente, o ROSE desempenha um papel fundamental na avaliação da adequação da amostragem e na orientação de procedimentos e técnicas de intervenção em tempo real².

Como subsidiária da tecnologia ROSE, a tecnologia M-ROSE se concentra principalmente na aquisição do histórico microbiológico das lesões-alvo, em vez de discernir entre células benignas e malignas ^3,4. Por um lado, o M-ROSE permite a identificação microscópica de patógenos como Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis e Candida⁵. Por outro lado, tem implicações orientadoras significativas na avaliação da qualidade da amostra respiratória, distinguindo doenças infecciosas de não infecciosas, discriminando infecção de contaminação, bem como avaliando a gravidade e o prognóstico da infecção ^6,7. Por exemplo, dentro de uma amostra respiratória, a coexistência de bactérias exibindo morfologia idêntica ao lado de células inflamatórias infiltrantes indica uma infecção; Por outro lado, a presença de múltiplas bactérias morfologicamente diversas acompanhadas por células epiteliais sugere contaminação. A capacidade de analisar informações clínicas de forma abrangente e prever resultados torna o M-ROSE uma ferramenta inestimável em procedimentos de doenças pulmonares.

Em conclusão, o ROSE serve como um transportador citológico crucial que aumenta significativamente a eficiência e a precisão do diagnóstico de doenças pulmonares. Seus recursos multifacetados contribuem para melhorar os resultados dos pacientes, garantindo uma intervenção oportuna e facilitando o diagnóstico preciso por meio de amostragem em tempo real e técnicas de intervenção diagnóstica. No entanto, é importante observar que esses avanços dependem da obtenção de amostras qualificadas. Aqui, apresentamos um protocolo M-ROSE padronizado que engloba a preparação da lâmina, técnicas de coloração e diretrizes de interpretação. Este protocolo serve como uma referência inestimável para os médicos estabelecerem planos precisos de avaliação e tratamento, facilitando a tomada de decisões sobre o manuseio subsequente de espécimes-alvo.

Protocolo

O ensaio clínico foi aprovado pelo Comitê de Aprovação do Hospital de Medicina Tradicional Chinesa de Chongqing (nº 2022-ky-31). O caso típico envolveu um paciente diagnosticado com pneumonia por Pneumocystis, e o consentimento informado foi obtido do paciente.

1. Requisitos de equipamentos e materiais para ROSE

1. Equipamento: Consulte o arquivo Tabela de Materiais para o equipamento usado neste protocolo.
   NOTA: A utilização de um microscópio citológico dedicado e um sistema de imagem gráfica é imperativa (Figura 1A).
2. Preparação de materiais (ver Tabela de Materiais).
   1. Prepare lâminas de cultura de células estéreis (com forte adesão celular), papel absorvente, luvas de látex sem pó, agulhas de seringa descartáveis de 2,5-5 mL e coloque o conjunto completo de soluções de coloração Diff Quik (DQ) em frascos de coloração de vidro com tampas seladas para facilitar o manuseio (Figura 1).

2. Fluxo de trabalho M-ROSE

1. Preparação de lâminas citológicas
   NOTA: Existem muitas maneiras de preparar slides, e a seguir estão vários métodos de preparação comumente usados.
   1. Rolar slides
      NOTA: Garanta uma perda mínima de amostra de tecido durante este processo.
      1. Extraia as partículas de tecido usando uma agulha de seringa descartável com capacidade de 2,5-5 mL (Figura 2A).
      2. Espalhe uma área circular, de aproximadamente 1 cm de diâmetro e espessura moderada, da seção interna para a externa de um terço da extremidade corada (a extremidade exibindo forte fixação celular) na lâmina de citologia estéril.
   2. Escovar slides
      NOTA: Este método é aplicável a amostras obtidas usando escovas de células convencionais, escovas de células antipoluição ou escovas de células ultrafinas, bem como amostras semilíquidas, como escarro e fluidos corporais viscosos.
      1. Estenda a cabeça da escova e aplique-a no terço distal da lâmina de vidro citológica estéril (a lâmina tem fortes propriedades de adesão celular) para obter uma área retangular de cerca de 2 cm x 1 cm com espessura moderada.
   3. Lâminas de pulverização
      1. Posicione a agulha de punção a um terço da extremidade corada de uma lâmina de citologia estéril com adesão celular robusta.
      2. Aplique pressão de ar na ponta da agulha perfurante e insira-a do lado interno para fora, formando uma área circular com espessura média medindo aproximadamente 1 cm de diâmetro.
2. Coloração citológica da lâmina
   NOTA: A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda a coloração rápida da lâmina citológica ROSE usando o corante de Diff⁵. O corante Diff pode ser reutilizado, mas não repetido muitas vezes. Se houver sedimentos, eles devem ser filtrados após o uso. O tingimento muito profundo pode ser adequadamente descolorido por metanol ou álcool, de preferência não mais tingido. Se o tingimento for muito profundo ou muito raso, o tempo de tingimento ou a concentração do líquido de trabalho devem ser ajustados; o valor do pH tem uma certa influência no tingimento, e a lâmina deve estar limpa e livre de poluição ácida e alcalina. Tanto a solução Diff A quanto a solução Diff B são voláteis e devem ser seladas e armazenadas após o uso.
   1. Mergulhe a lâmina em solução de Diff A por 10-30 s ( Figura 2B ) e, em seguida, enxágue-a no banho de corante PBS para remover o excesso de solução de Diff A e sacuda suavemente qualquer tampão restante ( Figura 2C ).
   2. Em seguida, mergulhe a lâmina na solução Diff B por 20-40 s (Figura 2E).
   3. Por fim, limpe a lâmina no tanque de tingimento de água (Figura 2F), seque e limpe o líquido residual da lâmina com papel absorvente (Figura 2D) e termine de tingir.
      NOTA: O M-ROSE permite a visualização direta de microrganismos patogênicos e facilita a avaliação da qualidade da amostra respiratória, permitindo a discriminação entre infecção e não infecção, bem como infecção e contaminação, o que tem significado orientador para a avaliação da gravidade e prognóstico da infecção. A seção de discussão cobrirá esse aspecto, pois não envolve nenhum procedimento experimental.

Resultados

Em um caso típico, um homem de 63 anos se apresentou ao hospital com tosse, febre e dor no peito. O paciente foi previamente diagnosticado com síndrome nefrótica, caracterizada por proteinúria e edema, e recebeu tratamento com prednisona e tacrolimo por um longo tempo. Os achados laboratoriais iniciais demonstraram contagem de leucócitos de 10,49 x 10⁹/L, contagem de neutrófilos de 8,87 x 10⁹/L, proteína C reativa no sangue total e concentrações de (1-3)-β-D-glucano de 155,81 mg/L e 249,7 ...

Discussão

A pneumologia intervencionista é um ramo valioso da doença respiratória moderna; em particular, tem sido amplamente utilizado no diagnóstico de doenças pulmonares ^8,9. Nos últimos anos, a pneumologia intervencionista diagnóstica tem prosperado devido ao aumento da prevalência de tumores malignos pulmonares, infecções por patógenos mais resistentes a medicamentos que ocorrem no trato respiratório inferior e solicitações exigentes de diagnóstico de d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101