Pulmoner Enfeksiyon Hastalıklarında Mikrobiyolojik Hızlı Yerinde Değerlendirme

Özet

Buradaki protokol, slayt yapımı, boyama ve yorumlama olmak üzere üç adımdan oluşan hızlı ve standartlaştırılmış bir mikrobiyolojik hızlı yerinde değerlendirme (M-ROSE) iş akışını göstermektedir. Bu protokol hekimlerin hızlı klinik kararlar almasına yardımcı olacaktır.

Özet

Açıklanamayan akciğer enfeksiyonu ile başvuran hastalarda ampirik anti-enfektif tedavinin hızlı bir şekilde başlatılması çok önemlidir. Klinik pratikte görüntüleme elde edilmesi nispeten basit olmasına rağmen, özgüllüğünün olmaması genellikle hastalığın altta yatan etiyolojisini doğru bir şekilde tanımlamak için balgam kültürü, bronkoalveoler-lavaj sıvı kültürü veya genetik dizileme gibi ek zaman alıcı testler gerektirir. Ayrıca, ampirik anti-enfektif tedavinin sınırlı etkinliği, antibiyotik kötüye kullanımına katkıda bulunabilir. Hızlı yerinde değerlendirme (ROSE) slaytlarında mikrobiyal arka planın yorumlanmasındaki son gelişmeler, klinisyenlerin bronkoskopi yoluyla (örneğin, alveoler lavaj, mukozal fırçalama, doku klempi) derhal numune almalarını sağlayarak, temel mikrobiyal arka plan bilgilerini sağlayan yatak başı boyamayı ve yorumlamayı kolaylaştırmıştır. Sonuç olarak, bu, hedefe yönelik anti-enfeksiyon tedavisi ve kişiselleştirilmiş ilaç tedavisi planları geliştirmek için bir temel oluşturur. Hangi patojenlerin gerçek zamanlı olarak enfeksiyonlara neden olduğunu daha iyi anlayarak, doktorlar antibiyotik direncine katkıda bulunan gereksiz geniş spektrumlu antibiyotiklerden kaçınabilirler. Solunum tıbbı departmanlarında veya yoğun bakım ünitelerinde hızlı ve standartlaştırılmış bir M-ROSE iş akışı oluşturmak, doktorlara hastalar için doğru tedavi stratejileri formüle etmede büyük ölçüde yardımcı olacaktır ve bu da önemli klinik çıkarımlara sahiptir.

Giriş

Hızlı yerinde değerlendirme tekniği (ROSE), akciğer hastalığı prosedürleri alanında kullanılan oldukça verimli bir yöntemdir. Anında sitolojik analizi kolaylaştırarak gerçek zamanlı örnekleme ve tanısal müdahaleye olanak tanır¹. Bu yenilikçi yaklaşım, doku örneğinin bir kısmının, bütünlüğünü koruyarak bir lam üzerine basılmasını içerir. ROSE'un en önemli avantajlarından biri, özel mikroskopi teknikleri aracılığıyla klinik bilgilerin hızlı bir şekilde yorumlanmasını kolaylaştırma kapasitesinde yatmaktadır. Bu, hücre morfolojisinin analizini, sınıflandırılmasını, nicelleştirilmesini, bileşen oranlarının belirlenmesini, düzenlemenin değerlendirilmesini, korelasyon analizini, arka planın değerlendirilmesini ve yabancı cisimlerin tanımlanmasını kapsar. ROSE, tüm bu verileri hastanın klinik bilgileriyle entegre ederek, örnekleme yeterliliğini değerlendirmede ve gerçek zamanlı girişimsel prosedür ve tekniklere rehberlik etmede çok önemli bir rol oynamaktadır².

ROSE teknolojisinin bir yan kuruluşu olan M-ROSE teknolojisi, iyi huylu ve kötü huylu hücreleri ayırt etmek yerine öncelikle hedef lezyonların mikrobiyolojik arka planını elde etmeye odaklanır ^3,4. Bir yandan M-ROSE, Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis ve Candida⁵ gibi patojenlerin mikroskobik olarak tanımlanmasını sağlar. Öte yandan, solunum örneği kalitesinin değerlendirilmesinde, bulaşıcı hastalıkların bulaşıcı olmayan hastalıklardan ayırt edilmesinde, enfeksiyonun kontaminasyondan ayırt edilmesinde ve ayrıca enfeksiyon şiddetinin ve prognozunun değerlendirilmesinde önemli yol gösterici etkilere sahiptir ^6,7. Örneğin, bir solunum örneği içinde, sızan enflamatuar hücrelerin yanı sıra aynı morfolojiyi sergileyen bakterilerin bir arada bulunması bir enfeksiyonu gösterir; Tersine, epitel hücrelerinin eşlik ettiği çok sayıda morfolojik olarak farklı bakterinin varlığı kontaminasyonu düşündürür. Klinik bilgileri kapsamlı bir şekilde analiz etme ve sonuçları tahmin etme kapasitesi, M-ROSE'u pulmoner hastalık prosedürlerinde paha biçilmez bir araç haline getirmektedir.

Sonuç olarak, ROSE, akciğer hastalıklarının teşhisinin etkinliğini ve hassasiyetini önemli ölçüde artıran çok önemli bir sitolojik taşıyıcı olarak hizmet eder. Çok yönlü yetenekleri, gerçek zamanlı örnekleme ve tanısal müdahale teknikleri aracılığıyla zamanında müdahale sağlayarak ve doğru teşhisi kolaylaştırarak hasta sonuçlarının iyileştirilmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, bu gelişmelerin nitelikli numunelerin elde edilmesine dayandığına dikkat etmek önemlidir. Burada, slayt hazırlama, boyama teknikleri ve yorumlama yönergelerini kapsayan standartlaştırılmış bir M-ROSE protokolü sunuyoruz. Bu protokol, klinisyenlerin doğru değerlendirme ve tedavi planları oluşturmaları için paha biçilmez bir referans görevi görürken, hedef numunelerin daha sonra ele alınmasına ilişkin karar vermeyi kolaylaştırır.

Protokol

Klinik araştırma, Chongqing Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi Onay Komitesi tarafından onaylanmıştır (No. 2022-ky-31). Tipik olguda Pneumocystis pnömonisi tanısı konulan bir hasta yer aldı ve hastadan bilgilendirilmiş onam alındı.

1. ROSE için ekipman ve malzeme gereksinimleri

1. Ekipman: Bu protokolde kullanılan ekipman için Malzeme Tablosu dosyasına bakın.
   NOT: Özel bir sitolojik mikroskop ve grafik görüntüleme sistemi kullanmak zorunludur (Şekil 1A).
2. Malzeme hazırlama (Malzeme Tablosuna bakınız).
   1. Steril hücre kültürü slaytları (güçlü hücre yapışması ile), emici kağıt, pudrasız lateks eldivenler, tek kullanımlık 2,5-5 mL şırınga iğneleri hazırlayın ve Diff Quik (DQ) boyama solüsyonlarının tamamını kolay kullanım için kapalı kapaklı cam boyama kavanozlarına yerleştirin (Şekil 1).

2. M-ROSE iş akışı

1. Sitolojik slaytların hazırlanması
   NOT: Slaytları hazırlamanın birçok yolu vardır ve aşağıda yaygın olarak kullanılan birkaç hazırlama yöntemi verilmiştir.
   1. Slaytları yuvarlayın
      NOT: Bu işlem sırasında doku numunesi kaybının minimum düzeyde olduğundan emin olun.
      1. 2.5-5 mL kapasiteli tek kullanımlık bir şırınga iğnesi kullanarak doku parçacıklarını çıkarın (Şekil 2A).
      2. Steril sitoloji lamı üzerine, yaklaşık 1 cm çapında ve orta kalınlıkta dairesel bir alanı, lekeli ucun (güçlü hücre bağlanması sergileyen uç) iç kısımdan dış üçte bir kısmına yayın.
   2. Fırça slaytları
      NOT: Bu yöntem, geleneksel hücre fırçaları, kirlilik önleyici hücre fırçaları veya ultra ince hücre fırçaları kullanılarak elde edilen numunelerin yanı sıra balgam ve viskoz vücut sıvıları gibi yarı sıvı numunelere uygulanabilir.
      1. Fırça kafasını uzatın ve orta kalınlıkta yaklaşık 2 cm x 1 cm'lik dikdörtgen bir alan elde etmek için steril sitolojik cam slaytın (slayt güçlü hücre yapışma özelliklerine sahiptir) distal üçte birlik kısmına uygulayın.
   3. Sprey slaytları
      1. Delme iğnesini, sağlam hücre yapışması ile steril bir sitoloji slaytının lekeli ucunun üçte birine yerleştirin.
      2. Delici iğnenin ucuna hava basıncı uygulayın ve yaklaşık 1 cm çapında orta kalınlıkta dairesel bir alan oluşturacak şekilde iç taraftan dışa doğru sokun.
2. Sitolojik slayt boyama
   NOT: Dünya Sağlık Örgütü (WHO), ROSE sitolojik slaytının Diff'in⁵ boyası kullanılarak hızlı bir şekilde boyanmasını önermektedir. Diferansiyel boyası tekrar kullanılabilir ancak birçok kez tekrarlanamaz. Tortu varsa, kullanımdan sonra süzülmelidir. Çok derin boyama, tercihen artık boyanmayan metanol veya alkol ile uygun şekilde renkten arındırılabilir. Boyama çok derin veya çok sığ ise, boyama süresi veya çalışma sıvısı konsantrasyonu ayarlanmalıdır; pH değerinin boyama üzerinde belirli bir etkisi vardır ve lam temiz olmalı ve asit ve alkali kirliliğinden arındırılmış olmalıdır. Hem Diff A çözeltisi hem de Diff B çözeltisi uçucudur ve kullanımdan sonra mühürlenmeli ve saklanmalıdır.
   1. Slaytı 10-30 saniye boyunca Diff A çözeltisine batırın (Şekil 2B), ardından fazla Diff A çözeltisini çıkarmak için PBS boya banyosunda durulayın ve kalan tamponu nazikçe sallayın (Şekil 2C).
   2. Ardından, slaytı 20-40 saniye boyunca Diff B çözeltisine daldırın (Şekil 2E).
   3. Son olarak, su boyama tankındaki sürgüyü temizleyin (Şekil 2F), sürgünün kalan sıvısını emici kağıtla kurulayın ve silin (Şekil 2D) ve boyamayı bitirin.
      NOT: M-ROSE, patojenik mikroorganizmaların doğrudan görüntülenmesini sağlar ve solunum örneği kalitesinin değerlendirilmesini kolaylaştırır, enfeksiyon şiddeti ve prognozunun değerlendirilmesi için yol gösterici öneme sahip olan enfeksiyon ve kontaminasyonun yanı sıra enfeksiyon ve enfeksiyon arasında ayrım yapılmasını sağlar. Tartışma bölümü, herhangi bir deneysel prosedür içermediği için bu yönü kapsayacaktır.

Sonuçlar

Tipik bir vakada, 63 yaşında bir erkek öksürük, ateş ve göğüs ağrısı ile hastaneye başvurdu. Hastaya daha önce proteinüri ve ödem ile karakterize nefrotik sendrom teşhisi kondu ve uzun süre prednizon ve takrolimus ile tedavi gördü. İlk laboratuvar bulgularında beyaz kan hücresi sayısı 10.49 x 10⁹/L, nötrofil sayısı 8.87 x 10⁹/L, tam kan C-reaktif protein ve (1-3)-β-D-glukan konsantrasyonları 155.81 mg/L ve 249.7 pg/mL olarak bulunmuştur. Göğüs bilgisayarlı tomograf...

Tartışmalar

Girişimsel pulmonoloji, modern solunum yolu hastalıklarının değerli bir dalıdır; Özellikle, akciğer hastalıklarının tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır ^8,9. Son yıllarda, pulmoner malign tümörlerin prevalansının artması, alt solunum yollarında ilaca dirençli patojen enfeksiyonlarının daha fazla ortaya çıkması ve şaşırtıcı ve kritik solunum yolu hastalıklarının tanısı için talepte bulunulması nedeniyle tanısal giriş...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101