Evaluación microbiológica rápida in situ para enfermedades infecciosas pulmonares

Resumen

El protocolo aquí demuestra un flujo de trabajo rápido y estandarizado de evaluación microbiológica rápida in situ (M-ROSE), que incluye tres pasos: fabricación de portaobjetos, tinción e interpretación. Este protocolo ayudará a los médicos a tomar decisiones clínicas rápidas.

Resumen

El inicio temprano de la terapia antiinfecciosa empírica es crucial en los pacientes que presentan una infección pulmonar inexplicable. Aunque la adquisición de imágenes es relativamente sencilla en la práctica clínica, su falta de especificidad a menudo requiere pruebas adicionales que requieren mucho tiempo, como el cultivo de esputo, el cultivo de líquido de lavado broncoalveolar o la secuenciación genética para identificar con precisión la etiología subyacente de la enfermedad. Además, la eficacia limitada del tratamiento antiinfeccioso empírico puede contribuir al mal uso de los antibióticos. Los avances recientes en la interpretación de los antecedentes microbianos en los portaobjetos de evaluación rápida in situ (ROSE) han permitido a los médicos obtener rápidamente muestras a través de la broncoscopia (p. ej., lavado alveolar, cepillado de mucosas, pinzamiento de tejido), lo que facilita la tinción y la interpretación a pie de cama que proporciona información esencial de antecedentes microbianos. En consecuencia, esto establece una base para el desarrollo de tratamientos antiinfecciosos específicos y planes de terapia farmacológica individualizados. Con una mejor comprensión de qué patógenos están causando infecciones en tiempo real, los médicos pueden evitar antibióticos innecesarios de amplio espectro que contribuyen a la resistencia a los antibióticos. El establecimiento de un flujo de trabajo rápido y estandarizado de M-ROSE dentro de los departamentos de medicina respiratoria o las unidades de cuidados intensivos ayudará en gran medida a los médicos a formular estrategias de tratamiento precisas para los pacientes, lo que tiene implicaciones clínicas significativas.

Introducción

La técnica de evaluación rápida in situ (ROSE) es un método altamente eficiente empleado en el campo de los procedimientos de enfermedad pulmonar. Permite la toma de muestras en tiempo real y la intervención diagnóstica, facilitando el análisis citológico inmediato¹. Este enfoque innovador consiste en imprimir una parte de la muestra de tejido en un portaobjetos mientras se preserva su integridad. Una de las principales ventajas de ROSE radica en su capacidad para facilitar la interpretación rápida de la información clínica mediante técnicas de microscopía especializadas. Esto abarca el análisis de la morfología celular, la clasificación, la cuantificación, la determinación de las proporciones de constituyentes, la evaluación de la disposición, el análisis de correlación, la evaluación de los antecedentes y la identificación de objetos extraños. Al integrar todos estos datos con la información clínica del paciente, ROSE desempeña un papel fundamental en la evaluación de la adecuación del muestreo y en la orientación de los procedimientos y técnicas de intervención en tiempo real².

Como subsidiaria de la tecnología ROSE, la tecnología M-ROSE se centra principalmente en la adquisición de los antecedentes microbiológicos de las lesiones objetivo en lugar de discernir entre células benignas y malignas ^3,4. Por un lado, M-ROSE permite la identificación microscópica de patógenos como Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis y Candida⁵. Por otro lado, tiene implicaciones orientadoras significativas en la evaluación de la calidad de las muestras respiratorias, distinguiendo las enfermedades infecciosas de las no infecciosas, discriminando la infección de la contaminación, así como evaluando la gravedad y el pronóstico de la infección ^6,7. Por ejemplo, dentro de un espécimen respiratorio, la coexistencia de bacterias que exhiben una morfología idéntica junto con células inflamatorias infiltrantes indica una infección; Por el contrario, la presencia de múltiples bacterias morfológicamente diversas acompañadas de células epiteliales sugiere contaminación. La capacidad de analizar exhaustivamente la información clínica y predecir los resultados hace de M-ROSE una herramienta inestimable en los procedimientos de enfermedades pulmonares.

En conclusión, ROSE sirve como un portador citológico crucial que mejora significativamente la eficiencia y la precisión del diagnóstico de enfermedades pulmonares. Sus capacidades multifacéticas contribuyen a mejorar los resultados de los pacientes al garantizar una intervención oportuna y facilitar un diagnóstico preciso a través de técnicas de intervención diagnóstica y muestreo en tiempo real. Sin embargo, es importante tener en cuenta que estos avances se basan en la obtención de muestras calificadas. En este artículo, presentamos un protocolo estandarizado M-ROSE que abarca la preparación de portaobjetos, técnicas de tinción y pautas de interpretación. Este protocolo sirve como una referencia invaluable para que los médicos establezcan planes precisos de evaluación y tratamiento, al tiempo que facilita la toma de decisiones con respecto al manejo posterior de las muestras objetivo.

Protocolo

El ensayo clínico ha sido aprobado por el Comité de Aprobación del Hospital de Medicina Tradicional China de Chongqing (No. 2022-ky-31). El caso típico involucró a un paciente diagnosticado con neumonía por Pneumocystis, y se obtuvo el consentimiento informado del paciente.

1. Requisitos de equipo y material para ROSE

1. Equipo: Consulte el archivo de la Tabla de Materiales para conocer el equipo utilizado en este protocolo.
   NOTA: Es imperativo utilizar un microscopio citológico dedicado y un sistema de imágenes gráficas (Figura 1A).
2. Preparación del material (ver Tabla de Materiales).
   1. Prepare portaobjetos estériles de cultivo celular (con una fuerte adhesión celular), papel absorbente, guantes de látex sin polvo, agujas de jeringa desechables de 2,5-5 ml y coloque el juego completo de soluciones de tinción Diff Quik (DQ) en frascos de vidrio con tapas selladas para facilitar su manejo (Figura 1).

2. Flujo de trabajo de M-ROSE

1. Preparación de portaobjetos citológicos
   NOTA: Hay muchas maneras de preparar portaobjetos, y los siguientes son varios métodos de preparación comúnmente utilizados.
   1. Correderas de rollo
      NOTA: Asegúrese de que la pérdida mínima de la muestra de tejido durante este proceso sea mínima.
      1. Extraiga las partículas de tejido utilizando una aguja de jeringa desechable con una capacidad de 2,5-5 mL (Figura 2A).
      2. Extienda un área circular, de aproximadamente 1 cm de diámetro y grosor moderado, desde la sección interna hasta la externa de un tercio del extremo teñido (el extremo exhibe una fuerte adhesión celular) en el portaobjetos de citología estéril.
   2. Deslizadores de pincel
      NOTA: Este método es aplicable a muestras obtenidas utilizando cepillos celulares convencionales, cepillos celulares anticontaminación o cepillos celulares ultrafinos, así como especímenes semilíquidos como esputo y fluidos corporales viscosos.
      1. Extienda el cabezal del cepillo y aplíquelo en el tercio distal del portaobjetos de vidrio citológico estéril (el portaobjetos tiene fuertes propiedades de adhesión celular) para obtener un área rectangular de aproximadamente 2 cm x 1 cm con un grosor moderado.
   3. Portaobjetos de pulverización
      1. Coloque la aguja de punción en un tercio del extremo teñido de un portaobjetos de citología estéril con una sólida adhesión celular.
      2. Aplique presión de aire en la punta de la aguja perforadora e insértela desde el lado interno hacia afuera, formando un área circular con un grosor medio de aproximadamente 1 cm de diámetro.
2. Tinción de portaobjetos citológicos
   NOTA: La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda la tinción rápida del portaobjetos citológico de ROSA con el colorante⁵ de Diff. El tinte Diff se puede reutilizar pero no se puede repetir muchas veces. Si hay sedimentos, deben filtrarse después de su uso. El teñido demasiado profundo puede ser decolorado adecuadamente por metanol o alcohol, preferiblemente ya no teñido. Si el teñido es demasiado profundo o demasiado superficial, se debe ajustar el tiempo de teñido o la concentración del líquido de trabajo; el valor de pH tiene cierta influencia en el teñido, y el portaobjetos debe estar limpio y libre de contaminación ácida y alcalina. Tanto la solución Diff A como la solución Diff B son volátiles y deben sellarse y almacenarse después de su uso.
   1. Sumerja el portaobjetos en una solución de Diff A durante 10-30 s (Figura 2B), luego enjuáguelo en el baño de tinte PBS para eliminar el exceso de solución de Diff A y sacuda suavemente cualquier tampón restante (Figura 2C).
   2. A continuación, sumerja el portaobjetos en la solución Diff B durante 20-40 s (Figura 2E).
   3. Finalmente, limpie el portaobjetos en el tanque de teñido con agua (Figura 2F), seque y limpie el líquido residual del portaobjetos con papel absorbente (Figura 2D) y termine de teñir.
      NOTA: M-Rose permite la visualización directa de microorganismos patógenos y facilita la evaluación de la calidad de las muestras respiratorias, lo que permite discriminar entre infección y no infección, así como infección y contaminación, lo que tiene una importancia orientadora para la evaluación de la gravedad y el pronóstico de la infección. La sección de discusión cubrirá este aspecto, ya que no implica ningún procedimiento experimental.

Resultados

En un caso típico, un hombre de 63 años acudió al hospital con tos, fiebre y dolor torácico. El paciente fue diagnosticado previamente de síndrome nefrótico, caracterizado por proteinuria y edema, y recibió tratamiento con prednisona y tacrolimus durante mucho tiempo. Los hallazgos iniciales de laboratorio demostraron un recuento de glóbulos blancos de 10,49 x 10⁹/L, recuentos de neutrófilos de 8,87 x 10⁹/L, proteínas C reactivas en sangre total y concentraciones de (1-3)-β-D-glucano de 1...

Discusión

La neumología intervencionista es una rama valiosa de las enfermedades respiratorias modernas; En particular, ha sido ampliamente utilizado en el diagnóstico de enfermedades pulmonares ^8,9. En los últimos años, la neumología intervencionista diagnóstica ha prosperado debido al aumento de la prevalencia de tumores malignos pulmonares, a las infecciones por patógenos más resistentes a los fármacos en el tracto respiratorio inferior y a las exigentes solici...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101