Valutazione microbiologica rapida in loco per le malattie infettive polmonari

Riepilogo

Il protocollo dimostra un flusso di lavoro rapido e standardizzato per la valutazione microbiologica rapida in loco (M-ROSE), che comprende tre fasi: creazione dei vetrini, colorazione e interpretazione. Questo protocollo aiuterà i medici a prendere decisioni cliniche rapide.

Abstract

L'avvio tempestivo di una terapia antinfettiva empirica è fondamentale nei pazienti che presentano un'infezione polmonare inspiegabile. Sebbene l'acquisizione dell'imaging sia relativamente semplice nella pratica clinica, la sua mancanza di specificità spesso richiede ulteriori test che richiedono molto tempo, come la coltura dell'espettorato, la coltura del liquido di lavaggio broncoalveolare o il sequenziamento genetico per identificare con precisione l'eziologia sottostante della malattia. Inoltre, la limitata efficacia del trattamento antinfettivo empirico può contribuire all'uso improprio di antibiotici. I recenti progressi nell'interpretazione del background microbico sui vetrini ROSE (Rapid On-Site Evaluation) hanno consentito ai medici di ottenere prontamente campioni attraverso la broncoscopia (ad esempio, lavaggio alveolare, spazzolamento della mucosa, clamp tissutale), facilitando la colorazione al letto del paziente e l'interpretazione che fornisce informazioni microbiche essenziali sul background. Di conseguenza, questo stabilisce le basi per lo sviluppo di trattamenti anti-infezione mirati e piani di terapia farmacologica personalizzati. Con una migliore comprensione di quali agenti patogeni stanno causando infezioni in tempo reale, i medici possono evitare antibiotici ad ampio spettro non necessari che contribuiscono alla resistenza agli antibiotici. La creazione di un flusso di lavoro M-ROSE rapido e standardizzato all'interno dei reparti di medicina respiratoria o delle unità di terapia intensiva aiuterà notevolmente i medici a formulare strategie di trattamento accurate per i pazienti, il che ha implicazioni cliniche significative.

Introduzione

La tecnica della valutazione rapida in loco (ROSE) è un metodo altamente efficiente impiegato nel campo delle procedure per le malattie polmonari. Consente il campionamento e l'intervento diagnostico in tempo reale, facilitando l'analisi citologica immediata¹. Questo approccio innovativo prevede l'imprinting di una parte del campione di tessuto su un vetrino, preservandone l'integrità. Uno dei principali vantaggi di ROSE risiede nella sua capacità di facilitare l'interpretazione tempestiva delle informazioni cliniche attraverso tecniche di microscopia specializzate. Ciò comprende l'analisi della morfologia cellulare, la classificazione, la quantificazione, la determinazione dei rapporti costituenti, la valutazione della disposizione, l'analisi di correlazione, la valutazione del fondo e l'identificazione di oggetti estranei. Integrando tutti questi dati con le informazioni cliniche del paziente, ROSE svolge un ruolo fondamentale nella valutazione dell'adeguatezza del campionamento e nella guida delle procedure e delle tecniche interventistiche in tempo reale².

In qualità di sussidiaria della tecnologia ROSE, la tecnologia M-ROSE si concentra principalmente sull'acquisizione del background microbiologico delle lesioni bersaglio piuttosto che sulla distinzione tra cellule benigne e maligne ^3,4. Da un lato, M-ROSE consente l'identificazione microscopica di agenti patogeni come Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis e Candida⁵. D'altra parte, ha implicazioni guida significative nella valutazione della qualità dei campioni respiratori, nella distinzione tra malattie infettive e non infettive, nella discriminazione dell'infezione dalla contaminazione, nonché nella valutazione della gravità e della prognosi dell'infezione ^6,7. Ad esempio, all'interno di un campione respiratorio, la coesistenza di batteri che presentano una morfologia identica insieme a cellule infiammatorie infiltranti indica un'infezione; Al contrario, la presenza di più batteri morfologicamente diversi accompagnati da cellule epiteliali suggerisce una contaminazione. La capacità di analizzare in modo completo le informazioni cliniche e di prevedere gli esiti rende M-ROSE uno strumento inestimabile nelle procedure per le malattie polmonari.

In conclusione, ROSE funge da vettore citologico cruciale che migliora significativamente l'efficienza e la precisione della diagnosi delle malattie polmonari. Le sue molteplici capacità contribuiscono a migliorare gli esiti dei pazienti, garantendo un intervento tempestivo e facilitando una diagnosi accurata attraverso tecniche di campionamento e intervento diagnostico in tempo reale. Tuttavia, è importante notare che questi progressi si basano sull'ottenimento di campioni qualificati. In questo articolo, presentiamo un protocollo M-ROSE standardizzato che comprende la preparazione dei vetrini, le tecniche di colorazione e le linee guida per l'interpretazione. Questo protocollo funge da riferimento inestimabile per i medici per stabilire piani di valutazione e trattamento accurati, facilitando al contempo il processo decisionale in merito alla successiva gestione dei campioni target.

Protocollo

Lo studio clinico è stato approvato dal Comitato di approvazione dell'Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese di Chongqing (n. 2022-ky-31). Il caso tipico riguardava un paziente con diagnosi di polmonite da Pneumocystis e il consenso informato è stato ottenuto dal paziente.

1. Requisiti delle attrezzature e dei materiali per ROSE

1. Attrezzatura: Fare riferimento alla Tabella dei materiali file per l'attrezzatura utilizzata in questo protocollo.
   NOTA: L'utilizzo di un microscopio citologico dedicato e di un sistema di imaging grafico è indispensabile (Figura 1A).
2. Preparazione del materiale (vedi Tabella dei materiali).
   1. Preparare vetrini sterili per colture cellulari (con forte adesione cellulare), carta assorbente, guanti in lattice senza polvere, aghi per siringa monouso da 2,5-5 ml e posizionare il set completo di soluzioni coloranti Diff Quik (DQ) in barattoli di vetro con coperchi sigillati per una facile manipolazione (Figura 1).

2. Flusso di lavoro M-ROSE

1. Preparazione di vetrini citologici
   NOTA: Esistono molti modi per preparare i vetrini e di seguito sono riportati diversi metodi di preparazione comunemente utilizzati.
   1. Scivoli a rullo
      NOTA: Garantire una perdita minima di campione di tessuto durante questo processo.
      1. Estrarre le particelle di tessuto utilizzando un ago per siringa monouso con una capacità di 2,5-5 ml (Figura 2A).
      2. Stendere un'area circolare, di circa 1 cm di diametro e di spessore moderato, dalla sezione interna a quella esterna di un terzo dell'estremità colorata (l'estremità che mostra un forte attaccamento cellulare) sul vetrino citologico sterile.
   2. Slitte a pennello
      NOTA: Questo metodo è applicabile a campioni ottenuti utilizzando spazzole cellulari convenzionali, spazzole cellulari anti-inquinamento o spazzole cellulari ultrafini, nonché campioni semiliquidi come espettorato e fluidi corporei viscosi.
      1. Estendere la testina e applicarla sul terzo distale del vetrino citologico sterile (il vetrino ha forti proprietà di adesione cellulare) per ottenere un'area rettangolare di circa 2 cm x 1 cm con uno spessore moderato.
   3. Scivoli spray
      1. Posizionare l'ago da puntura su un terzo dell'estremità colorata di un vetrino citologico sterile con una robusta adesione cellulare.
      2. Applicare una pressione d'aria sulla punta dell'ago da piercing e inserirlo dal lato interno verso l'esterno, formando un'area circolare di medio spessore di circa 1 cm di diametro.
2. Colorazione citologica dei vetrini
   NOTA: L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) raccomanda la colorazione rapida del vetrino citologico ROSE utilizzando il^{colorante 5} di Diff. Il colorante Diff può essere riutilizzato ma non ripetuto molte volte. Se sono presenti sedimenti, devono essere filtrati dopo l'uso. La tintura troppo profonda può essere adeguatamente decolorata da metanolo o alcol, preferibilmente non più colorato. Se la tintura è troppo profonda o troppo superficiale, è necessario regolare il tempo di tintura o la concentrazione del liquido di lavoro; il valore del pH ha una certa influenza sulla tintura e il vetrino deve essere pulito e privo di inquinamento acido e alcalino. Sia la soluzione Diff A che la soluzione Diff B sono volatili e devono essere sigillate e conservate dopo l'uso.
   1. Immergere il vetrino nella soluzione di Diff A per 10-30 s (Figura 2B), quindi sciacquarlo nel bagno di tintura PBS per rimuovere la soluzione di Diff A in eccesso e scuotere delicatamente il tampone rimanente (Figura 2C).
   2. Quindi, immergere il vetrino nella soluzione Diff B per 20-40 s (Figura 2E).
   3. Infine, pulire il vetrino nella vasca di tintura ad acqua (Figura 2F), tamponare e asciugare il liquido residuo del vetrino con carta assorbente (Figura 2D) e terminare la tintura.
      NOTA: M-ROSE consente la visualizzazione diretta dei microrganismi patogeni e facilita la valutazione della qualità dei campioni respiratori, consentendo la discriminazione tra infezione e non infezione, nonché tra infezione e contaminazione, che ha un significato guida per la valutazione della gravità e della prognosi dell'infezione. La sezione di discussione tratterà questo aspetto in quanto non prevede alcuna procedura sperimentale.

Risultati

In un caso tipico, un uomo di 63 anni si è presentato in ospedale con tosse, febbre e dolore toracico. Al paziente era stata precedentemente diagnosticata la sindrome nefrosica, caratterizzata da proteinuria ed edema, e ha ricevuto un trattamento con prednisone e tacrolimus per lungo tempo. I risultati iniziali di laboratorio hanno dimostrato una conta dei globuli bianchi di 10,49 x 10⁹/L, una conta dei neutrofili di 8,87 x 10⁹/L, una proteina C-reattiva nel sangue intero e concentrazioni di (1-3)-...

Discussione

La pneumologia interventistica è una branca preziosa delle moderne malattie respiratorie; In particolare, è stato ampiamente utilizzato nella diagnosi delle malattie polmonari ^8,9. Negli ultimi anni, la pneumologia interventistica diagnostica ha prosperato a causa dell'aumento della prevalenza di tumori maligni polmonari, delle infezioni da agenti patogeni più resistenti ai farmaci che si verificano nel tratto respiratorio inferiore e delle richieste di diagno...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101