הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר למחלות זיהומיות ריאתיות

Summary

הפרוטוקול כאן מדגים זרימת עבודה מהירה ומתוקננת של הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר הלקוח (M-ROSE), הכוללת שלושה שלבים: יצירת שקופיות, צביעה ופענוח. פרוטוקול זה יסייע לרופאים לקבל החלטות קליניות מהירות.

Abstract

ההתחלה המהירה של טיפול אמפירי אנטי זיהומי היא קריטית בחולים המציגים זיהום ריאתי בלתי מוסבר. למרות שרכישת הדמיה היא פשוטה יחסית בפרקטיקה הקלינית, חוסר הספציפיות שלה מחייב לעתים קרובות בדיקות נוספות הגוזלות זמן רב כגון תרבית כיח, תרבית נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי או ריצוף גנטי כדי לזהות את האטיולוגיה הבסיסית של המחלה במדויק. יתר על כן, היעילות המוגבלת של טיפול אמפירי אנטי זיהומי עלולה לתרום לשימוש לרעה באנטיביוטיקה. ההתקדמות האחרונה בפענוח רקע מיקרוביאלי בשקופיות הערכה מהירה באתר (ROSE) אפשרה לרופאים להשיג דגימות במהירות באמצעות ברונכוסקופיה (למשל, שטיפת נאדיות, צחצוח רירית, מהדק רקמות), מה שמקל על צביעה לצד המיטה ופרשנות המספקת מידע רקע מיקרוביאלי חיוני. כתוצאה מכך, זה מבסס בסיס לפיתוח טיפול ממוקד נגד זיהום ותוכניות טיפול תרופתי אישיות. עם הבנה טובה יותר של אילו פתוגנים גורמים לזיהומים בזמן אמת, רופאים יכולים להימנע מאנטיביוטיקה רחבת טווח מיותרת התורמת לעמידות לאנטיביוטיקה. הקמת תהליך עבודה מהיר וסטנדרטי של M-ROSE במחלקות לרפואה נשימתית או ביחידות לטיפול נמרץ תסייע רבות לרופאים לגבש אסטרטגיות טיפול מדויקות לחולים, דבר שיש לו השלכות קליניות משמעותיות.

Introduction

הטכניקה של הערכה מהירה באתר (ROSE) היא שיטה יעילה ביותר המיושמת בתחום הליכי מחלות ריאה. הוא מאפשר דגימה בזמן אמת והתערבות אבחנתית, ומאפשר ניתוח ציטולוגי מיידי¹. גישה חדשנית זו כוללת הטבעה של חלק מדגימת הרקמה על שקופית תוך שמירה על שלמותה. אחד היתרונות העיקריים של ROSE טמון ביכולתו להקל על פרשנות מהירה של מידע קליני באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה מיוחדות. זה כולל ניתוח של מורפולוגיה של התא, סיווג, כימות, קביעת יחסים מרכיבים, הערכת סידור, ניתוח מתאם, הערכת רקע, וזיהוי של אובייקטים זרים. על ידי שילוב כל הנתונים הללו עם המידע הקליני של המטופל, ROSE ממלא תפקיד מרכזי בהערכת הלימות הדגימה ובהנחיית הליכים וטכניקות התערבותיות בזמן אמת².

כחברת בת של טכנולוגיית ROSE, טכנולוגיית M-ROSE מתמקדת בעיקר ברכישת הרקע המיקרוביולוגי של נגעי מטרה במקום להבחין בין תאים שפירים לממאירים ^3,4. מצד אחד, M-ROSE מאפשר זיהוי מיקרוסקופי של פתוגנים כגון אספרגילוס, קריפטוקוקוס, פנאומוציסטיס וקנדידה⁵. מצד שני, יש לו השלכות מנחות משמעותיות בהערכת איכות הדגימות הנשימתיות, הבחנה בין מחלות זיהומיות ללא זיהומיות, הבחנה בין זיהום לזיהום, כמו גם הערכת חומרת זיהום ופרוגנוזה ^6,7. לדוגמה, בתוך דגימה נשימתית, דו-קיום של חיידקים בעלי מורפולוגיה זהה לצד חדירת תאי דלקת מצביע על זיהום; לעומת זאת, נוכחותם של חיידקים רבים בעלי מגוון מורפולוגי המלווים בתאי אפיתל מצביעה על זיהום. היכולת לנתח באופן מקיף מידע קליני ולחזות תוצאות הופכת את M-ROSE לכלי רב ערך בהליכים של מחלות ריאה.

לסיכום, ROSE משמש כנשא ציטולוגי חיוני המשפר משמעותית את היעילות והדיוק של אבחון מחלות ריאה. יכולותיו הרב-גוניות תורמות לשיפור תוצאות המטופלים בכך שהן מבטיחות התערבות בזמן ומקלות על אבחון מדויק באמצעות טכניקות דגימה והתערבות אבחונית בזמן אמת. עם זאת, חשוב לציין כי התקדמות זו מסתמכת על השגת דגימות מוסמכות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול M-ROSE סטנדרטי הכולל הכנת שקופיות, טכניקות צביעה והנחיות פרשנות. פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות רבת ערך עבור קלינאים כדי לקבוע תוכניות הערכה וטיפול מדויקות תוך הקלה על קבלת החלטות לגבי טיפול עוקב בדגימות מטרה.

Protocol

הניסוי הקליני אושר על ידי ועדת האישורים של בית החולים צ'ונגצ'ינג לרפואה סינית מסורתית (מס '2022-ky-31). המקרה הטיפוסי כלל חולה שאובחן עם דלקת ריאות פנאומוציסטיס, והתקבלה הסכמה מדעת מהמטופל.

1. דרישות ציוד וחומרים עבור ROSE

1. ציוד: עיין בקובץ טבלת החומרים עבור הציוד המשמש בפרוטוקול זה.
   הערה: שימוש במיקרוסקופ ציטולוגי ייעודי ובמערכת הדמיה גרפית הוא הכרחי (איור 1A).
2. הכנת חומרים (ראה טבלת חומרים).
   1. הכינו שקופיות סטריליות של תרביות תאים (עם הדבקה חזקה של תאים), נייר סופג, כפפות לטקס ללא אבקה, מחטי מזרק חד פעמיות בנפח 2.5-5 מ"ל, והניחו את הסט המלא של תמיסות צביעה של Diff Quik (DQ) בצנצנות צביעת זכוכית עם מכסים אטומים לטיפול קל (איור 1).

2. זרימת עבודה של M-ROSE

1. הכנת שקופיות ציטולוגיות
   הערה: קיימות דרכים רבות להכנת שקופיות, ולהלן מספר שיטות הכנה נפוצות.
   1. גלגול שקופיות
      הערה: ודא אובדן מינימלי של דגימת רקמה במהלך תהליך זה.
      1. חלצו חלקיקי רקמה באמצעות מחט מזרק חד-פעמית עם קיבולת של 2.5-5 מ"ל (איור 2A).
      2. פורסים שטח עגול, בקוטר של כ-1 ס"מ ובעובי בינוני, מהשליש הפנימי לחיצוני של הקצה המוכתם (הקצה בעל חיבור תאים חזק) על שקופית הציטולוגיה הסטרילית.
   2. מברשת שקופיות
      הערה: שיטה זו ישימה לדגימות המתקבלות באמצעות מברשות תאים קונבנציונליות, מברשות תאים מונעות זיהום או מברשות תאים עדינות במיוחד, כמו גם דגימות נוזליות למחצה כגון כיח ונוזלי גוף צמיגים.
      1. האריכו את ראש המברשת והניחו אותו על השליש הדיסטלי של מגלשת הזכוכית הציטולוגית הסטרילית (למגלשה תכונות היצמדות תאים חזקות) לקבלת שטח מלבני של כ-2X1 ס"מ בעובי בינוני.
   3. ריסוס שקופיות
      1. מקם את מחט הניקוב בשליש מהקצה המוכתם של שקופית ציטולוגיה סטרילית עם היצמדות תאים חזקה.
      2. הפעילו לחץ אוויר על קצה המחט החודרת והכניסו אותו מהצד הפנימי כלפי חוץ, ויצרו אזור עגול בעובי בינוני בקוטר של כ-1 ס"מ.
2. צביעת שקופית ציטולוגית
   הערה: ארגון הבריאות העולמי (WHO) ממליץ על צביעה מהירה של שקופית ציטולוגית ROSE באמצעות צבע⁵ של Diff. ניתן לעשות שימוש חוזר בצבע Diff אך לא לחזור עליו פעמים רבות. אם יש משקעים, יש לסנן אותם לאחר השימוש. צביעה עמוקה מדי יכולה להיות דה-צבעית כראוי על ידי מתנול או אלכוהול, רצוי לא צבוע יותר. אם הצביעה עמוקה מדי או רדודה מדי, יש להתאים את זמן הצביעה או את ריכוז נוזל העבודה; לערך ה- pH יש השפעה מסוימת על הצביעה, והמגלשה צריכה להיות נקייה וללא זיהום חומצה ואלקלי. גם תמיסת Diff A וגם תמיסת Diff B נדיפים ויש לאטום ולאחסן אותן לאחר השימוש.
   1. השקיעו את השקופית בתמיסת Diff A למשך 10-30 שניות (איור 2B), ואז שטפו אותה באמבט הצבע PBS כדי להסיר תמיסת Diff A עודפת ונערו בעדינות את כל החיץ שנותר (איור 2C).
   2. לאחר מכן, טבלו את השקופית בתמיסת Diff B למשך 20-40 שניות (איור 2E).
   3. לבסוף, נקו את השקופית במיכל צביעת המים (איור 2F), נגבו את שאריות הנוזל של המגלשה עם נייר סופג (איור 2D), וסיימו לצבוע.
      הערה: M-ROSE מאפשר הדמיה ישירה של מיקרואורגניזמים פתוגניים ומקל על הערכת איכות הדגימות הנשימתיות, ומאפשר הבחנה בין זיהום ללא זיהום וכן זיהום וזיהום, שיש לו משמעות מנחה להערכת חומרת הזיהום והפרוגנוזה. פרק הדיון יכסה היבט זה מכיוון שהוא אינו כרוך בהליכים ניסיוניים כלשהם.

תוצאות

במקרה טיפוסי, גבר בן 63 הגיע לבית החולים עם שיעול, חום וכאבים בחזה. החולה אובחן בעבר עם תסמונת נפרוטית, המאופיינת בפרוטאינוריה ובבצקת, וקיבל טיפול בפרדניזון וטקרולימוס במשך זמן רב. ממצאי המעבדה הראשוניים הדגימו ספירת תאי דם לבנים של 10.49 x 10⁹/L, ספירת נויטרופילים של 8.87 x 10⁹/L, חלבון מג?...

Discussion

פולמונולוגיה התערבותית היא ענף חשוב של מחלות נשימה מודרניות; בפרט, זה כבר בשימוש נרחב באבחון של מחלות ריאה ^8,9. בשנים האחרונות, פולמונולוגיה התערבותית אבחנתית משגשגת בשל שכיחות מוגברת של גידולים ממאירים ריאתיים, יותר זיהומים פתוגניים עמידים לתרופות המתרחשי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytological microscope	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) staining solutions	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Disposable 2.5-5 mL syringe needles	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Powder-free latex gloves	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Sterile cell culture slides	Jinan Preret industry and trade Co., LTD	7101