JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم الببتيدات ذاتية التجميع الوظيفية الحيوية من أجل التصاق الخلايا ، والتشكل العضوي ، والتعبير الجيني عن طريق التلوين المناعي. سوف نستخدم خط خلايا سرطان القولون والمستقيم لتوفير طريقة فعالة من حيث التكلفة للحصول على المواد العضوية للاختبار المكثف.

Abstract

يمكن للببتيدات ذاتية التجميع فائقة القصر (SAPs) أن تشكل تلقائيا أليافا نانوية تشبه المصفوفة خارج الخلية. تسمح هذه الألياف بتكوين الهلاميات المائية المتوافقة حيويا والقابلة للتحلل الحيوي وغير المناعية. لقد أثبتنا سابقا أن SAPs ، عندما تعمل بيولوجيا بزخارف مشتقة من البروتين ، يمكن أن تحاكي خصائص المصفوفة خارج الخلية التي تدعم تكوين عضويات القولون والمستقيم. تحتفظ هذه الهلاميات المائية الببتيدية الوظيفية الحيوية بالخصائص الميكانيكية للببتيد الأصلي ، وقابلية الضبط ، وقابلية الطباعة مع دمج الإشارات التي تسمح لتفاعلات مصفوفة الخلية بزيادة التصاق الخلايا. تقدم هذه الورقة البروتوكولات اللازمة لتقييم وتوصيف تأثيرات مختلف الهلاميات المائية الببتيد الوظيفية الحيوية على التصاق الخلايا وتكوين التجويف باستخدام خط خلايا سرطان الورم الغدي القادر على تكوين عضويات سرطان القولون والمستقيم بشكل فعال من حيث التكلفة. ستساعد هذه البروتوكولات في تقييم تأثيرات هيدروجيل الببتيد الوظيفي الحيوي على التصاق الخلايا وتكوين اللمعان باستخدام تحليل الصور المناعية والتألقية. تم استخدام خط الخلية المستخدم في هذه الدراسة سابقا لتوليد المواد العضوية في المصفوفات المشتقة من.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، ظهرت الببتيدات ذاتية التجميع (SAPs) كمواد حيوية واعدة لتطبيقات هندسة الأنسجة. تمتلك SAPs خصائص فريدة ، بما في ذلك التكوين التلقائي للألياف النانوية ، والتوافق الحيوي ، والتحلل البيولوجي ، وعدم الاستمناع ، مما يجعلها مرشحة جذابة لتطوير السقالات1. تم استخدام SAPs سابقا مع أنواع مختلفة من الخلايا ، وعلى وجه الخصوص ، سهلت SAPs فائقة القصر تغليف الخلايا الجذعية مع الحفاظ على تعدد قدراتها على مدى فترات طويلة تشمل أكثر من 30 ممرا وبأقل قدر من حدوث انحرافات الكروموسومات2،3،4. ومن ثم ، فإن تكييف برامج التكيف الهيكلي لاستخدامها في الثقافة العضوية شكل خطوة عقلانية لاحقة.

المواد العضوية هي هياكل معقدة ثلاثية الأبعاد تنشأ من خلايا مفردة متعددة القدرات. تؤدي هذه الهياكل إلى ظهور أنواع مختلفة من الخلايا ، والتي تنظم نفسها ذاتيا لتكرار العمليات التنموية للنمو الجنيني والأنسجة في المختبر5. تطور هذا الإطار المبتكر إلى أداة هائلة للتحقيقات في المختبر ، والحفاظ بكفاءة على السمات الجينية والمظهرية والسلوكية المميزة للأعضاء في الجسم الحي 6. ومع ذلك ، فإن العائق الرئيسي في الانتقال من مقاعد البدلاء إلى السرير للنتائج القائمة على العضوية هو الحاجة إلى التكرار7. يعزى هذا التباين في النتائج في المقام الأول إلى صعوبة التمييز الكامل للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى سلالات خلايا متخصصة ، بالإضافة إلى عدم وجود بنية أنسجة أصلية والتعقيد المتأصل الذي تمت مواجهته في النماذج العضوية. نظرا لارتفاع شعبية الدراسات القائمة على الخلايا الجذعية والعضوية8 ، كان هناك طلب متزايد على المواد الحيوية ذات الخواص الميكانيكية الديناميكية ومواقع الالتصاق الشبيهة بالأنتغرين أو السقالات ذات قابلية التحلل الخاضعة للرقابة 7,9. يمكن ضبط هذه السمات بشكل فعال من خلال الاستخدام الاستراتيجي لبرامج التكيف الهيكلي الوظيفية الحيوية.

SAPs عبارة عن تسلسلات قصيرة من الأحماض الأمينية مع القدرة المتأصلة على التنظيم التلقائي في هياكل محددة جيدا10. غالبا ما تحتوي هذه الببتيدات على بقايا متناوبة كارهة للماء ومحبة للماء ، والتي تدفع تجميعها الذاتي من خلال التفاعلات غير التساهمية ، بما في ذلك الترابط الهيدروجيني والتفاعلات الكهروستاتيكية والتأثيرات الكارهة للماء11,12. إن عملية التجميع الذاتي لهذه الببتيدات مدفوعة في المقام الأول بالحاجة إلى تقليل الطاقة الحرة للنظام. عندما تكون في بيئة مائية ، تميل المخلفات الكارهة للماء إلى التجمع معا لتقليل تعرضها للماء ، بينما تتفاعل المخلفات المحبة للماء مع جزيئات الماء المحيطة. هذه الظاهرة تؤدي إلى تشكيل الهياكل النانوية المختلفة. في هذه الحالة ، تشكل الببتيدات ذاتية التجميع فائقة القصر أليافا نانوية ذات خصائص تعتمد على تسلسل الببتيد والظروف البيئية2،12،13،14،15،16. تتبنى هذه الببتيدات شكلا β الدوران ، حيث تصطف خيوط الببتيد الفردية بالتوازي أو التوازي مع بعضها البعض ، ويتم تثبيتها بواسطة روابط هيدروجينية (الشكل 1). يؤدي وجود الأيونات الموجبة إلى تسريع عمليات التجميع الذاتي التي تؤدي إلى تكوين الألياف النانوية.

تم تحديد ألياف الببتيد النانوية على أنها تمتلك قدرة فطرية على حبس كميات كبيرة من الماء. تسهل هذه الخاصية توليد هيدروجيل ، والذي يتجلى لاحقا كمساحة ثلاثية الأبعاد متوافقة حيويا وقابلة للتحلل الحيوي تفضي إلى تكاثر الخلايا ونموها. تحاكي هذه الألياف النانوية الببتيد ذاتية التجميع بشكل معقد السمات الطبوغرافية المتأصلة في بيئة المصفوفة الطبيعية خارج الخلية (ECM)1. يمنح هذا التشابه الخلايا بيئة تقلد بيئتها الفسيولوجية ، مما يعزز الأنشطة الخلوية المثلى17. علاوة على ذلك ، فإن التنوع المتأصل في هذه الببتيدات يسمح بدرجة كبيرة من الضبط4. تتيح هذه القدرة على التكيف إجراء تغييرات على خصائص المصفوفة ، مثل الصلابة وحركية الهلام والمسامية. يتم تحقيق هذه التعديلات من خلال التعديلات على تسلسل الببتيد. وبالتالي ، ظهرت الببتيدات ذاتية التجميع (SAPs) كمكونات محورية في علوم المواد الحيوية المعاصرة ، وتستخدم على نطاق واسع كسقالات لتجديد الأنسجة والزراعة الخلوية13،17.

تتمثل إحدى المزايا الحاسمة للببتيدات ذاتية التجميع في قدرتها على تصنيعها وتعديلها بسهولة على المستوى الجزيئي. تسمح هذه الميزة بدمج مجموعات وظيفية محددة أو زخارف نشطة بيولوجيا في تسلسل الببتيد ، مما يتيح تصميم الببتيدات بخصائص ووظائف مخصصة18،19،20 (الشكل 1 ب). على سبيل المثال ، يمكن تصميم SAPs ذات الوظائف الحيوية لتقليد ECM وتعزيز التمايز باستخدام الببتيد RGD19,21. كما تم الإبلاغ عن أن الببتيد Ben-IKVAV يزيد بشكل كبير من التعبير عن العلامات الخاصة بالخلايا العصبية بسبب حركته الخاصةبالرباط 22. يمكن أيضا هندسة هذه الببتيدات لعرض الجزيئات النشطة بيولوجيا ، مثل الببتيدات المرتبطة بالأنتغرين ، لتعزيز بقاء الخلية23. أخيرا ، تم تطوير برامج التكيف الهيكلي الأخرى ذات الوظائف الحيوية لتعزيز تكوين الأوعية من خلال تضمين زخارف IKVAV و YIGSR في هياكلها24.

تظهر برامج التكيف الهيكلي الوظيفية بيولوجيا التي تم الإبلاغ عنها في منشور سابق أنه يمكن تعديل التجميع الذاتي بشكل أكبر من خلال تضمين الببتيد الساذج الذي اشتق منه SAP الوظيفي بيولوجيا25. يمكن أن توفر مخاليط SAP هذه أيضا مجموعة واسعة من تركيبات SAP التي تختلف في نشاطها الكيميائي الحيوي وخصائصها الفيزيائية والكيميائية. على سبيل المثال ، الببتيد البرمائي IIFK هو SAP قصير جدا يمكنه تحمل الوظائف الحيوية بزخارف مختلفة ، ويتجلى ذلك في دمج شكل IKVAV (الشكل 1B). يمكن أن يشكل كلا الببتيدات أليافا نانوية ، بمفردها ومجتمعة. ينتج عن كل تركيبة هلاميات مائية ذات خصائص فيزيائية مختلفة (الشكل 2)

ومع ذلك ، بسبب المجموعة الواسعة من التباديل والبدائل المحتملة التي تم الحصول عليها من الأداء الحيوي ل SAPs ، هناك حاجة لتوفير خيار سريع وفعال من حيث التكلفة لاختبار المواد العضوية. أحد المرشحين لمثل هذا التقييم العضوي المكثف والفعال من حيث التكلفة هو خط خلايا SW1222 ، المشتق من سرطان القولون والمستقيم الغديالبشري 26,27. تمتلك خلايا SW1222 خصائص تمكن من تجميعها في هياكل 3D تشبه الكائنات العضوية ، مما يجعلها نموذجا مثاليا لدراسة تطور الأنسجة وتطبيقات الطب التجديدي. تم تحديد خلايا SW1222 على أنها قادرة على توليد المواد العضوية بسبب الإفراط في التعبير الجوهري عن جين LGR5 27. تم عرض إنشاء المواد العضوية من الخلايا الجذعية الفردية LGR5 + بشكل مقنع من قبل ، بالإضافة إلى ميل خلايا SW1222 لتحقيق الخصائص المورفولوجية لسرطان القولون والمستقيم28.

في ورقة الطرق هذه ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتقييم وتوصيف تأثيرات الببتيدات الوظيفية الحيوية المختلفة على التصاق الخلايا وتكوين التجويف باستخدام خلايا SW1222 (الشكل 3). من خلال توفير إجراءات خطوة بخطوة وطرق تحليل التصوير ، نأمل في تقديم رؤى قيمة حول التصنيع الحيوي للعضويات وتقييم مصفوفات SAP المبسطة للثقافة العضوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. العازلة وإعداد الحل

ملاحظة: جميع التركيزات المذكورة هي تركيزات نهائية.

  1. أضف مصل الأبقار الجنينية (FBS) والبنسلين-الستربتومايسين بتركيز نهائي قدره 10٪ و 1٪ على التوالي ، لتحضير وسط دولبيكو المعدل الكامل من Iscove (IMDM). يحفظ في الظلام على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  2. امزج MgCl2 (3 mM) والسكروز (300 mM) و Triton X-100 (0.5٪) في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) لتحضير المخزن المؤقت للنفاذية. تخزين هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  3. اجمع بين ألبومين مصل الأبقار (BSA ، 1٪) ، والجلايسين (0.3 M) ، و Tween-20 (0.1٪) في PBS لإعداد مخزن مؤقت للحظر. تخزين هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  4. تمييع 10x إلى 2x PBS بالماء عالي النقاء في ظل ظروف معقمة. قم بتخزين هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة لأكثر من 6 أشهر.
  5. تعقيم 3 ملغ من مسحوق الببتيد تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. أضف 500 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ليذوب باستخدام خلاط دوامة.
    ملاحظة: يجب أن يكون التركيز النهائي ضعف التركيز المستهدف ، أي 6 مجم / مل ، حيث سيكون تركيز 1x 3 مجم / مل.

2. تصنيع سرطان القولون والمستقيم العضوي من SW1222 في الببتيد

  1. قم بإذابة القسمة طوال الليل عند 4 درجات مئوية واحتفظ بها في الثلج لحين الحاجة إليها لتحضير التحكم في مصفوفة الطابق السفلي.
  2. ضع قطرة 10 ميكرولتر من محلول الببتيد 2x في وسط كل بئر في لوحة 24 بئرا. اترك اللوحة تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بدلا من ذلك ، قم بإيداع 8-10 قطرات لكل بئر في لوحة من 6 آبار.
    ملاحظة: يمكن الوصول إلى العينات التي من المفترض استخدامها في المجهر البؤري والمجهري الإلكتروني بشكل أكبر للتلاعب بها إذا تم زرعها فوق غطاء معقم.
  3. أضف 10 ميكرولتر من 2x PBS. امزج محلول PBS برفق باستخدام الحافة. اترك المواد الهلامية تستقر لمدة 20 دقيقة على الأقل ، مع ضمان بقاء القطرات سليمة تقريبا.
    ملاحظة: الهدف من إضافة PBS والخلط اللطيف هو الحفاظ على سلامة القطرة وتجنب انتشار الهيدروجيل في طبقة.
  4. افصل خلايا SW1222 باستخدام محلول 0.125٪ تربسين-EDTA (5 مل). احتضان الخلايا مع التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق حتى تنفصل عن القارورة. امتنع عن النقر على القارورة لتجنب تكتل الخلايا.
  5. أضف 5 مل من الوسط الكامل لتعطيل التربسين. قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 30 ميكرومتر. بدلا من ذلك ، استخدم حقنة بإبرة 25 جم لتعطيل الركام.
  6. تحضير معلق خلية من 0.4 × 106 خلايا / مل وحقن 2 ميكرولتر من معلق الخلية في كل قطرة ببتيد باستخدام ماصة ميكروية 10 ميكرولتر.
  7. احتضان القطرات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. أضف 0.5 مل من الوسط المكمل إلى كل بئر بعد الحضانة.
  8. أثناء الانتظار ، قم بإعداد التحكم في مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق تخفيف المخزون الرئيسي (8-12 مجم / مل ، اعتمادا على اللوت) إلى تركيز نهائي قدره 3 مجم / مل باستخدام الوسط المكمل. أضف خلايا إلى هذا المحلول (800 خلية لكل 25 ميكرولتر).
    ملاحظة: يجب أن يتم التلاعب بالغشاء القاعدي على الجليد في جميع الأوقات. يجب شطف النصائح في برنامج تلفزيوني بارد قبل لمس الهيدروجيل. خلاف ذلك ، سوف تحدث البلمرة داخل النصائح.
  9. لوحة 20 ميكرولتر قطرات من محلول الغشاء القاعدي في كل بئر. اترك القطرات تتكاثر عن طريق الحضانة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد تبلور المادة ، أضف 0.5 مل من الوسط الكامل.
  10. تغيير الوسيط كل 3-4 أيام. راقب الخلايا التي تنظم وتظهر إشارات تكوين التجويف في وقت مبكر من اليوم 4.
  11. خلايا الصورة في برايتفيلد في اليوم 1 واليوم 4 واليوم 7 لتقييم نمو الكائنات العضوية.

3. الجدوى والانتشار

  1. قم بإعداد ثلاث لوحات للبئر الأسود لفحص الصلاحية وثلاث لوحات للبئر الأسود لمقايسة الانتشار. أضف 25 ميكرولتر من محلول الببتيد 2x لكل بئر وجيلات باستخدام نفس الحجم من 2x PBS. بذر الخلايا كما هو موضح أعلاه.
  2. قم بإعداد ثلاثة آبار لكل تركيبة من هيدروجيل الببتيد لاستخدامها كفراغات في لوحة الانتشار. لا تزرع الخلايا على هذه.
  3. قم بإزالة الوسط من لوحة البئر الصالحة للاستمرار واغسله باستخدام 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  4. قم بتخفيف Calcein-AM و ethidium homodimer إلى 8 μM من مجموعة الصلاحية / السمية الخلوية لخلايا الثدييات (انظر جدول المواد) في نفس الأنبوب المخروطي المحمي بالضوء. لتحضير 2 مل من هذا المحلول إلى 2 مل من PBS في أنبوب مخروطي محمي بالضوء ، أضف 4 ميكرولتر من محلول مخزون Calcein-AM و 8 ميكرولتر من محلول مخزون Ethidium homodimer-1.
  5. أضف محلول الكالسيين / إيثيديوم هوموديمير المحضر في الخطوة 3.4 إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر. يحفظ بعيدا عن الضوء ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  6. يغسل لمدة 3 × 5 دقائق مع 1x PBS. تخيل ما لا يقل عن ثلاثة حقول (وسط ، أعلى ، أسفل) عند استخدام هدف 4x أو خمسة حقول على الأقل (وسط ، أعلى يسار ، أعلى يمين ، أسفل يسار ، أسفل يمين) عند استخدام هدف 10x و 20x تحت مجهر مضان.
  7. قم بإزالة الوسط من لوحة بئر الانتشار لضمان حجم نهائي يبلغ 90 ميكرولتر.
  8. أضف 10 ميكرولتر من محلول Alamar Blue (انظر جدول المواد) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 10٪.
  9. يحفظ بعيدا عن الضوء ويحتضن لمدة 2-4 ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2
  10. استخدم قارئ لوحة جيدة لقياس التألق (Ex / Em = 530-560 / 590 نانومتر / نانومتر) أو الامتصاص (570 نانومتر). متوسط القيم التي تم الحصول عليها للفراغات وطرحها من القيم من كل بئر يحتوي على خلايا.
  11. احسب قيم الانتشار عن طريق حساب متوسط إشارة كل حالة وطرح متوسط الفراغات الخاصة بكل منها. قم بإنشاء رسوم بيانية عن طريق إنشاء مخطط مربع مفهرس لإشارة الامتصاص النسبي / التألق مقابل الوقت.

4. اختبار التصاق الخلايا بالمصفوفة

  1. تحضير 100 ميكرولتر من الهلاميات المائية الببتيد في لوحين مستقلين من 96 بئرا.
  2. بذر 20000 خلية في كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من الوسط. احتضان الألواح لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
  3. بعد الحضانة ، خذ صفيحة واحدة فقط وأعد تعليق الوسيط بعناية باستخدام ماصة P200 لمدة 20-30 ثانية. احرص على عدم تعطيل الهيدروجيل عن طريق الحفاظ على الطرف من الجل. بدلا من ذلك ، إذا سمحت الخواص الميكانيكية للهيدروجيل بذلك (G '> 8000 باسكال) ، فانقر فوق الجوانب الأربعة للوحة البئر باستخدام دوامة متحركة.
    ملاحظة: سيؤدي تعليق الوسائط (أو النقر على لوحة البئر بالدوامة) إلى إزالة كل من الخلايا غير المتصلة والخلايا ذات الالتصاق الضعيف بسطح المصفوفة. سيحدث المرفق الخلوي في غضون 90 دقيقة ، على الرغم من أن قوة هذا المرفق ستختلف اعتمادا على الهلاميات المائية الببتيد المحددة وخصائصها اللاصقة والملزمة. من المعروف أن نمو القولون والمستقيم العضوي مفضل في المصفوفات ذات قيم الصلابة التي تقل عن 2000 باسكال. ومن ثم ، نظرا لأن الهلاميات المائية المقدمة في هذا البروتوكول ناعمة وهشة ، فإننا نحرص على استخدام الإجهاد الميكانيكي اللطيف.
  4. قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من كلا لوحتي البئر وأضف الغسيل مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
  5. قم بإعداد محلول DAPI 1 ميكروغرام / مل. أضف 100 ميكرولتر من محلول DAPI إلى جميع الآبار واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. تخيل عددا تمثيليا من الحقول تحت المجهر الفلوري. تأكد من الحصول على جميع الصور باستخدام نفس الهدف للحفاظ على نسبة البكسل / المسافة ثابتة.
    ملاحظة: قم بتصوير تسعة حقول لهدف 10x أو 15 حقلا بهدف 20x.
  7. قم بتحميل الصور الفلورية على برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال ، ImageJ) وقم بتحليل الجسيمات على جميع الصور.
    1. من قائمة الصورة ، حدد النوع وانقر فوق 8 بت.
    2. من قائمة الصورة ، حدد ضبط وانقر على السطوع / التباين. انقر فوق الزر "تلقائي " | تطبيق.
    3. من قائمة الصورة ، حدد ضبط وانقر فوق العتبة. انقر فوق الزر "تلقائي " وأغلق النافذة.
    4. من قائمة التحليل ، انقر فوق تحليل الجسيمات. حدد خيار التلخيص وانقر فوق موافق.
    5. في نافذة الملخص ، مرر مؤشر الماوس فوق القائمة ملف وانقر فوق حفظ لحفظ قيم الملخص.
  8. تصدير النتائج لجميع الصور إلى برنامج الإحصائيات القياسي.
  9. احسب النسبة المئوية للمساحة التي تغطيها الخلايا قبل وبعد الإجهاد. قم بعمل مخطط مربع مفهرس للنسبة المئوية للمساحة مقابل كل شرط.

5. التلوين المناعي للعضويات في هيدروجيل الببتيد

  1. بذر 800 خلية في قطرات 20 ميكرولتر من هيدروجيل الببتيد لمدة 4 أيام ، كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.10.
  2. في اليوم 4 ، قم بإزالة الوسيط واغسل كل بئر 2x باستخدام 1x PBS.
  3. أضف 400 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 4٪. احتضان لوحة البئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. قم بإزالة محلول الفورمالديهايد باستخدام P1000 واغسله مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
  5. أضف 1 مل من محلول النفاذية واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية باستخدام P1000 واغسله مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
  7. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت المانع واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر باستخدام P1000 واغسله باستخدام 1x PBS.
  9. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي في المخزن المؤقت المانع وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). أضف 200 ميكرولتر إلى بئرين.
  10. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  11. قم بإزالة محلول التلوين باستخدام P200 واغسله مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
  12. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي في المخزن المؤقت المانع ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). أضف اقتران القضيب بنسبة 1:40 في محلول الأجسام المضادة الثانوي.
  13. يحفظ بعيدا عن الضوء ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 3 ساعات. قم بإزالة محلول التلوين باستخدام P200 واغسله مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
  14. قم بإعداد محلول DAPI بمقدار 1 ميكروغرام / مل في المخزن المؤقت للحظر. أضف 300 ميكرولتر من محلول DAPI إلى كل بئر.
  15. يحفظ بعيدا عن الضوء ويحتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  16. قم بإزالة محلول التلوين باستخدام P200 واغسله مرة واحدة باستخدام 1x PBS.
  17. يحفظ بعيدا عن الضوء ويخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.

6. التصوير وتحليل الصور من المواد العضوية في مصفوفة

  1. صور العينات الملطخة باستخدام مجهر التألق عند 10x. استخدم فقط قنوات phalloidin و DAPI.
  2. افتح برنامج Cellopose واضغط على ctrl + L لتحميل صورة. نظرا لأن البرنامج سيتمكن من الوصول إلى جميع الملفات الموجودة في موقع الصورة المحددة ، تأكد من حفظ جميع الصور الفلورية في الموقع المحدد دون الحاجة إلى أي مجلدات فرعية.
  3. اكتب متوسط قطر المستعمرات في لوحة التجزئة وانقر ENTER.
  4. حدد نموذجا مخصصا لعضويات القولون وانقر على زر تشغيل النموذج .
    ملاحظة: هنا ، نقترح استخدام نموذجين من الصفر في Cellpose2.029,30
  5. اضغط على ctrl + s لحفظ الأقنعة كملف .npy.
  6. استخدم أسهم لوحة المفاتيح للتنقل عبر صور المجلد وتشغيل نموذج النقطتين العضوية على جميع الصور الموجودة في المجلد.
  7. قم بعمل نسخة من المجلد وكرر الخطوات 6.2-6.6 باستخدام نموذج لتجويف القولون العضوي.
  8. افتح ImageJ وانقر على البرنامج المساعد | وحدات الماكرو | ركض... لتشغيل ملف imagej_roi_converter.py المتاح من موقع Cellpose Github وانتظر ظهور نافذة.
  9. حدد الملف الأول من مجلد النقطتين العضوي وانقر فوق فتح.
  10. حدد ملف seg.npy المقابل للملف الأول وانقر فوق فتح.
    ملاحظة: ستقوم ImageJ بتحويل الأقنعة إلى مناطق ذات أهمية وتداخلها مع الصور الفلورية المقابلة.
  11. انقر فوق تحديد الكل في نافذة مدير عائد الاستثمار وانقر فوق قياس.
  12. انقر فوق ملف | حفظ باسم... في نافذة النتائج واحفظ النتائج.
    ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى ملف .csv يحتوي على كافة خصائص الشكل لكل مستعمرة في الحقل.
  13. كرر الخطوات 6.8-6.12 لنفس الصورة في المجلد الخاص بتجويف القولون العضوي.
  14. قم بتحميل OriginPro واضغط على ctrl + 3 لفتح معالج الاستيراد. انقر فوق زر النقاط الثلاث وحدد كلا الملفين .csv المقابلة لخصائص الشكل العضوي والتجويف لنفس الصورة.
  15. انسخ والصق النتائج من خصائص شكل التجويف في عمود واحد بجوار نتائج المستعمرة للتأكد من إقران كل قياس لومن بالمستعمرة الخاصة به.
  16. في عمود جديد ، قسم مناطق التجويف والمستعمرة للحصول على مساحة التجويف النسبية للمستعمرة المحتوية عليها.
  17. حدد العمود المقابل لدائرية كل مستعمرة ومنطقة التجويف. انقر على قطعة أرض | 2D الأساسية | مبعثر.
  18. انقر بزر الماوس الأيمن فوق نافذة المؤامرة وحدد تفاصيل المؤامرة. انقر فوق علامة التبويب Centroid (PRO) وحدد الخيارات التي تقرأ إظهار نقطة Centroid لمجموعة فرعية ، والاتصال بنقاط البيانات ، وإظهار القطع الناقص.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

أولا ، قمنا بتقييم الخلايا المزروعة في لوحة 24 بئرا لمدة 7 أيام باستخدام تصوير برايتفيلد. حددنا مجموعات صغيرة من الخلايا تتجمع في عضويات خلال الأسبوع، كما هو موضح في الشكل 4. يمكن أن تتبع طريقة المسح الخاضعة للرقابة حركة الخلايا والمواد العضوية بين الأيام المختلفة. بشكل عام ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يتم التأكيد على الإمكانات الهائلة لبرامج التكيف الهيكلي في البحوث الطبية الحيوية من خلال قابليتها للطرق والتكيف من خلال الوظائف الحيوية. مع هذه المجموعة الواسعة من التباديل ، ينشأ التحدي في اختبار وتحديد التكوينات الواعدة بكفاءة لتطبيقات محددة ، خاصة في أبحاث الكائنات العضوية. الحل الس?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية. يشيد المؤلفون بمنحة صندوق التمويل الأولي لجامعة الملك عبدالله للعلوم والتقنية وصندوق الابتكار في جامعة الملك عبدالله للعلوم والتقنية الذي يمنحه قسم الابتكار والتنمية الاقتصادية في جامعة الملك عبدالله للعلوم والتقنية. ويود المؤلفون أن يشكروا المختبرات الأساسية للعلوم البيولوجية والتصوير في جامعة الملك عبدالله للعلوم والتقنية لدعمها التوصيف البيولوجي والتحليلات المجهرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco14190144
6-well plate, tissue culture treatedCorning07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesiumGibco70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo Scientific28906
24-well plate, tissue culture treatedCorning09-761-146
96-well black plate, tissue culture treatedCorning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonalAbcamab40839Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonalAbcamab16505Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonalAbcamab190085Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAObtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633Invitrogen35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cellsInvitrogenL3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red freeCorning356255Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Round Cover Slip, 10 mm diameterVWR631-0170
Scanning Electron MicroscopeThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 μm strainerSysmex04-004-2326
sucroseSigma-AldrichS1888
SW1222 cell lineECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure waterInvitrogen10977015

References

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
  3. Loo, Y., et al. Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration. Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).
  4. Loo, Y., et al. Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures. Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).
  5. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  6. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  7. Kim, S., et al. Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids. Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).
  8. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  9. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  10. Hauser, C. A., et al. Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).
  11. Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices. Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).
  12. Rauf, S., et al. Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions. Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).
  13. Bilalis, P., et al. Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).
  14. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  15. Moretti, M., et al. Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration. Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).
  16. Alhattab, D. M., et al. Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system. Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).
  17. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  18. Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery. Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).
  19. Yan, Y., et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair. Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).
  20. Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).
  21. Hogrebe, N. J., et al. Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel. Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).
  22. Wu, F. J., Lin, H. C. Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles. Molecules. 27 (13), 4115(2022).
  23. Cringoli, M. C., et al. Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs. Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).
  24. Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis. Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).
  25. Pérez-Pedroza, R., et al. Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink. International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).
  26. Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors. Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).
  27. Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).
  28. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  29. Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).
  30. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  31. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  32. Humphries, M. J. Cell-substrate adhesion assays. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  33. Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration. Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).
  34. Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).
  35. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  36. Matthews, J. M., et al. OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics. PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).
  37. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  38. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).
  39. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).
  40. Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer. Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).
  41. Yadav, N., et al. Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).
  42. Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SW1222

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved