تصنيع وتوصيف عضويات سرطان القولون والمستقيم من خط خلية SW1222 في مصفوفة الببتيد ذاتية التجميع فائقة القصر

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم الببتيدات ذاتية التجميع الوظيفية الحيوية من أجل التصاق الخلايا ، والتشكل العضوي ، والتعبير الجيني عن طريق التلوين المناعي. سوف نستخدم خط خلايا سرطان القولون والمستقيم لتوفير طريقة فعالة من حيث التكلفة للحصول على المواد العضوية للاختبار المكثف.

Abstract

يمكن للببتيدات ذاتية التجميع فائقة القصر (SAPs) أن تشكل تلقائيا أليافا نانوية تشبه المصفوفة خارج الخلية. تسمح هذه الألياف بتكوين الهلاميات المائية المتوافقة حيويا والقابلة للتحلل الحيوي وغير المناعية. لقد أثبتنا سابقا أن SAPs ، عندما تعمل بيولوجيا بزخارف مشتقة من البروتين ، يمكن أن تحاكي خصائص المصفوفة خارج الخلية التي تدعم تكوين عضويات القولون والمستقيم. تحتفظ هذه الهلاميات المائية الببتيدية الوظيفية الحيوية بالخصائص الميكانيكية للببتيد الأصلي ، وقابلية الضبط ، وقابلية الطباعة مع دمج الإشارات التي تسمح لتفاعلات مصفوفة الخلية بزيادة التصاق الخلايا. تقدم هذه الورقة البروتوكولات اللازمة لتقييم وتوصيف تأثيرات مختلف الهلاميات المائية الببتيد الوظيفية الحيوية على التصاق الخلايا وتكوين التجويف باستخدام خط خلايا سرطان الورم الغدي القادر على تكوين عضويات سرطان القولون والمستقيم بشكل فعال من حيث التكلفة. ستساعد هذه البروتوكولات في تقييم تأثيرات هيدروجيل الببتيد الوظيفي الحيوي على التصاق الخلايا وتكوين اللمعان باستخدام تحليل الصور المناعية والتألقية. تم استخدام خط الخلية المستخدم في هذه الدراسة سابقا لتوليد المواد العضوية في المصفوفات المشتقة من.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، ظهرت الببتيدات ذاتية التجميع (SAPs) كمواد حيوية واعدة لتطبيقات هندسة الأنسجة. تمتلك SAPs خصائص فريدة ، بما في ذلك التكوين التلقائي للألياف النانوية ، والتوافق الحيوي ، والتحلل البيولوجي ، وعدم الاستمناع ، مما يجعلها مرشحة جذابة لتطوير السقالات¹. تم استخدام SAPs سابقا مع أنواع مختلفة من الخلايا ، وعلى وجه الخصوص ، سهلت SAPs فائقة القصر تغليف الخلايا الجذعية مع الحفاظ على تعدد قدراتها على مدى فترات طويلة تشمل أكثر من 30 ممرا وبأقل قدر من حدوث انحرافات الكروموسومات^2،3،4. ومن ثم ، فإن تكييف برامج التكيف الهيكلي لا....

Protocol

1. العازلة وإعداد الحل

ملاحظة: جميع التركيزات المذكورة هي تركيزات نهائية.

1. أضف مصل الأبقار الجنينية (FBS) والبنسلين-الستربتومايسين بتركيز نهائي قدره 10٪ و 1٪ على التوالي ، لتحضير وسط دولبيكو المعدل الكامل من Iscove (IMDM). يحفظ في الظلام على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
2. امزج MgCl₂ (3 mM) والسكروز (300 mM) و Triton X-100 (0.5٪) في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) لتحضير المخزن المؤقت للنفاذية. تخزين هذا الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
3. اجمع بين ألبومين مصل الأبقار (BSA ، 1٪) ، والجلايسين (0.3 M) ، و Tween-20 (0.1٪) في PBS لإعداد مخزن مؤقت للحظر. تخزين هذا الحل في 4 در....

النتائج

أولا ، قمنا بتقييم الخلايا المزروعة في لوحة 24 بئرا لمدة 7 أيام باستخدام تصوير برايتفيلد. حددنا مجموعات صغيرة من الخلايا تتجمع في عضويات خلال الأسبوع، كما هو موضح في الشكل 4. يمكن أن تتبع طريقة المسح الخاضعة للرقابة حركة الخلايا والمواد العضوية بين الأيام المختلفة. بشكل عام ?.......

Discussion

يتم التأكيد على الإمكانات الهائلة لبرامج التكيف الهيكلي في البحوث الطبية الحيوية من خلال قابليتها للطرق والتكيف من خلال الوظائف الحيوية. مع هذه المجموعة الواسعة من التباديل ، ينشأ التحدي في اختبار وتحديد التكوينات الواعدة بكفاءة لتطبيقات محددة ، خاصة في أبحاث الكائنات العضوية. الحل الس?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015