JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, immün boyama ile hücre adezyonu, organoid morfolojisi ve gen ekspresyonu için biyofonksiyonel kendi kendine birleşen peptitleri değerlendirmeyi amaçlar. Yoğun testler için organoidleri elde etmenin uygun maliyetli bir yolunu sağlamak için bir kolorektal kanser hücre hattı kullanacağız.

Özet

Ultra kısa kendi kendine birleşen peptitler (SAP'ler) kendiliğinden hücre dışı matrise benzeyen nanofiberler oluşturabilir. Bu lifler, biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen ve immünojenik olmayan hidrojellerin oluşumuna izin verir. SAP'lerin, protein türevi motiflerle biyoişlevsel hale getirildiğinde, kolorektal organoid oluşumunu destekleyen hücre dışı matris özelliklerini taklit edebileceğini daha önce kanıtlamıştık. Bu biyofonksiyonel peptit hidrojeller, hücre-matris etkileşimlerinin hücre yapışmasını artırmasına izin veren ipuçlarını içerirken, orijinal ana peptitin mekanik özelliklerini, ayarlanabilirliğini ve yazdırılabilirliğini korur. Bu makale, kolorektal kanser organoidleri oluşturabilen bir adenokarsinom kanser hücre hattı kullanarak çeşitli biyofonksiyonel peptit hidrojellerin hücre yapışması ve lümen oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve karakterize etmek için gereken protokolleri sunmaktadır. Bu protokoller, immün boyama ve floresan görüntü analizi kullanılarak hücre yapışması ve luminal oluşumu üzerindeki biyofonksiyonel peptit hidrojel etkilerinin değerlendirilmesine yardımcı olacaktır. Bu çalışmada kullanılan hücre dizisi, daha önce hayvan türevli matrislerde organoidler üretmek için kullanılmıştır.

Giriş

Son yıllarda, kendi kendine birleşen peptitler (SAP'ler), doku mühendisliği uygulamaları için umut verici biyomalzemeler olarak ortaya çıkmıştır. SAP'ler, nanoliflerin kendiliğinden oluşumu, biyouyumluluk, biyolojik olarak parçalanabilirlik ve immünojenisite olmama gibi benzersiz özelliklere sahiptir ve bu da onları iskele geliştirme için çekici adaylar haline getirir1. SAP'ler daha önce çeşitli hücre tipleri ile birlikte kullanılmıştır ve özellikle, bildirilen ultra kısa SAP'ler, 30'dan fazla geçişi kapsayan ve minimum kromozomal anormallik insidansı ile uzun süreler boyunca pluripotentliklerini korurken kök hücrelerin kapsüllenmesini kolaylaştırmıştır 2,3,4. Bu nedenle, SAP'lerin organoid kültürde kullanımları için uyarlanması rasyonel bir sonraki adımı oluşturmuştur.

Organoidler, tek pluripotent hücrelerden ortaya çıkan karmaşık üç boyutlu yapılardır. Bu yapılar, daha sonra embriyonik ve doku büyümesinin gelişimsel süreçlerini in vitro5 çoğaltmak için kendi kendini organize eden çeşitli hücre tiplerine yol açar. Bu yenilikçi çerçeve, in vivo organların karakteristik genetik, fenotipik ve davranışsal özelliklerini verimli bir şekilde koruyarak in vitro araştırmalar için zorlu bir araç haline gelmiştir6. Bununla birlikte, organoid bazlı bulguların tezgahtan başucuna geçişindeki temel bir engel, tekrarlanabilirlik ihtiyacıdır7. Sonuçlardaki bu varyasyon, öncelikle, otantik doku mimarisinin olmaması ve organoid modellerde karşılaşılan doğal karmaşıklık ile birleşen, insan pluripotent kök hücrelerini özel hücre soylarına tam olarak ayırt etmenin zorluğuna atfedilir. Kök hücre ve organoid bazlı çalışmaların8 popülaritesindeki artış göz önüne alındığında, dinamik mekanik özelliklere ve integrin benzeri yapışma bölgelerine veya kontrollü bozunabilirliğe sahip iskelelere sahip biyomalzemelere yönelik artan bir talep olmuştur 7,9. Bu özellikler, biyoişlevselleştirilmiş SAP'lerin stratejik kullanımı yoluyla etkili bir şekilde ayarlanabilir.

SAP'ler, iyi tanımlanmış yapılar halinde kendiliğinden organize olma yeteneğine sahip kısa amino asit dizileridir10. Bu peptitler genellikle, hidrojen bağı, elektrostatik etkileşimler ve hidrofobik etkiler11,12 dahil olmak üzere kovalent olmayan etkileşimler yoluyla kendi kendine montajlarını sağlayan alternatif hidrofobik ve hidrofilik kalıntılar içerir. Bu peptitlerin kendi kendine toplanma süreci, öncelikle sistemin serbest enerjisini en aza indirme ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Sulu bir ortamdayken, hidrofobik kalıntılar suya maruz kalmalarını en aza indirmek için bir araya toplanma eğilimindeyken, hidrofilik kalıntılar çevredeki su molekülleri ile etkileşime girer. Bu fenomen çeşitli nanoyapıların oluşumuna yol açar. Bu durumda, ultra kısa kendi kendine birleşen peptitler, peptit dizisine ve çevresel koşullara bağlı özelliklere sahip nanolifler oluşturur 2,12,13,14,15,16. Bu peptitler, tek tek peptit ipliklerinin birbirine paralel veya antiparalel hizalandığı ve hidrojen bağları ile stabilize edildiği β dönüşlü bir konformasyonu benimser (Şekil 1). Pozitif iyonların varlığı, nanolif oluşumuna yol açan kendi kendine birleşme işlemlerini hızlandırır.

Peptit nanofiberlerin, önemli miktarda suyu hapsetmek için doğuştan gelen bir yeteneğe sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu özellik, daha sonra hücresel çoğalma ve büyümeye elverişli biyouyumlu ve biyolojik olarak parçalanabilen üç boyutlu bir alan olarak ortaya çıkan bir hidrojelin oluşumunu kolaylaştırır. Bu kendi kendine birleşen peptit nanofiberler, doğal hücre dışı matris (ECM) ortamına özgü topografik özellikleri karmaşık bir şekilde taklit eder1. Bu benzerlik, hücrelere fizyolojik yaşam alanlarını taklit eden bir ortam sağlar ve optimal hücresel aktiviteleri daha da teşvik eder17. Ayrıca, bu peptitlerin doğasında bulunan çok yönlülük, önemli ölçüde ayarlanabilirliğe izin verir4. Bu tür bir uyarlanabilirlik, matrisin sertlik, jelleşme kinetiği ve gözeneklilik gibi özelliklerinde değişiklikler yapılmasını sağlar. Bu adaptasyonlar, peptit dizisinde yapılan modifikasyonlar yoluyla elde edilir. Sonuç olarak, kendiliğinden birleşen peptitler (SAP'ler), çağdaş biyomateryal biliminde çok önemli bileşenler olarak ortaya çıkmış ve doku rejenerasyonu ve hücresel kültür için yaygın olarak iskele olarak kullanılmıştır13,17.

Kendi kendine birleşen peptitlerin kritik avantajlarından biri, moleküler düzeyde kolayca sentezlenebilme ve modifiye edilebilme yetenekleridir. Bu avantaj, spesifik fonksiyonel grupların veya biyoaktif motiflerin peptit dizisine dahil edilmesine izin vererek, özel özelliklere ve işlevlere sahip peptitlerin tasarımını mümkün kılar 18,19,20 (Şekil 1B). Örneğin, biyo-işlevselleştirilmiş SAP'ler, ECM'yi taklit etmek ve RGD peptidi19,21 kullanılarak farklılaşmayı teşvik etmek için tasarlanabilir. Peptit Ben-IKVAV'ın ayrıca ligand'a özgü motiety22 nedeniyle nöronal spesifik belirteçlerin ekspresyonunu önemli ölçüde arttırdığı bildirilmiştir. Bu peptitler ayrıca, hücre sağkalımını artırmak için integrin bağlayıcı peptitler gibi biyoaktif molekülleri gösterecek şekilde tasarlanabilir23. Son olarak, yapılarına IKVAV ve YIGSR motiflerini dahil ederek anjiyogenezi teşvik etmek için diğer biyofonksiyonelleştirilmiş SAP'ler geliştirilmiştir24.

Daha önceki bir yayında bildirilen biyoişlevselleştirilmiş SAP'ler, kendi kendine montajın, biyoişlevselleştirilmiş SAP'nin türetildiği saf peptit dahil edilerek daha da modifiye edilebileceğini göstermektedir25. Bu SAP karışımları, biyokimyasal aktivitelerine ve fizikokimyasal özelliklerine göre değişen çok çeşitli SAP formülasyonları da sağlayabilir. Örneğin, amfifilik peptit IIFK, IKVAV motifinin dahil edilmesiyle örneklenen, çeşitli motiflerle biyoişlevselleştirmeye dayanabilen ultra kısa bir SAP'dir (Şekil 1B). Her iki peptit de hem tek başına hem de kombine olarak nanolifler oluşturabilir. Her formülasyon, farklı fiziksel özelliklere sahip hidrojellerle sonuçlanır (Şekil 2)

Bununla birlikte, SAP'lerin biyoişlevselleştirilmesinden elde edilen çok çeşitli potansiyel permütasyonlar ve alternatifler nedeniyle, organoid testi için hızlı ve uygun maliyetli bir seçenek sunmaya ihtiyaç vardır. Bu tür yoğun ve uygun maliyetli organoid değerlendirmesi için bir aday, insan kolorektal adenokarsinomundantüretilen SW1222 hücre hattıdır 26,27. SW1222 hücreleri, organoidlere benzeyen 3 boyutlu yapılar halinde toplanmalarını sağlayan özelliklere sahiptir, bu da onları doku gelişimi ve rejeneratif tıp uygulamalarını incelemek için ideal bir model haline getirir. SW1222 hücrelerinin, LGR5 geni27'nin içsel aşırı ekspresyonu nedeniyle organoid üretme yeteneğine sahip olduğu tespit edilmiştir. Bireysel LGR5 + kök hücrelerinden organoidlerin yaratılması, SW1222 hücrelerinin bir kolorektal kanser organoidinin morfolojik özelliklerini elde etme eğiliminin yanı sıra daha önce ikna edici bir şekilde sergilenmiştir28.

Bu yöntem makalesinde, SW1222 hücreleri kullanılarak çeşitli biyofonksiyonel peptitlerin hücre yapışması ve lümen oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz (Şekil 3). Adım adım prosedürler ve görüntüleme analiz yöntemleri sağlayarak, organoidlerin biyofabrikasyonu ve organoid kültürü için basit SAP matrislerinin değerlendirilmesi hakkında değerli bilgiler sunmayı umuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Tampon ve çözelti hazırlama

NOT: Belirtilen tüm konsantrasyonlar nihai konsantrasyonlardır.

  1. Tam Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unu (IMDM) hazırlamak için sırasıyla% 10 ve% 1'lik bir nihai konsantrasyonda fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
  2. Geçirgenlik tamponunu hazırlamak için MgCl2 (3 mM), sükroz (300 mM) ve Triton X-100'ü (% 0.5) fosfat tampon salin (PBS) içinde karıştırın. Bu solüsyonu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
  3. Bir bloke edici tampon hazırlamak için sığır serum albümini (BSA,% 1), glisin (0.3 M) ve Tween-20'yi (% 0.1) PBS'de birleştirin. Bu solüsyonu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
  4. Steril koşullar altında 10x ila 2x PBS'yi ultra saf suyla seyreltin. Bu çözeltiyi 6 aydan fazla oda sıcaklığında saklayın.
  5. 3 mg peptit tozunu ultraviyole ışık altında 30 dakika sterilize edin. Bir girdap karıştırıcı kullanarak çözmek için 500 μL ultra saf su ekleyin.
    NOT: Nihai konsantrasyon hedef konsantrasyonun iki katı olmalıdır, yani 6x konsantrasyon 1x konsantrasyon 3 mg / mL olacağından 3 mg / mL.

2. Peptitte SW1222'den kolorektal kanser organoid üretimi

  1. Bir alikotu gece boyunca 4 °C'de çözdürün ve bodrum matrisi kontrolünü hazırlamak için gerekene kadar buzda tutun.
  2. 24 oyuklu bir plakada her bir oyuğun ortasına 10 μL'lik bir damla 2x peptit çözeltisi yerleştirin. Plakanın oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Alternatif olarak, 6 oyuklu bir plakada oyuk başına 8-10 damlacık biriktirin.
    NOT: Konfokal ve elektron mikroskobunda kullanılması amaçlanan numuneler, steril bir lamel üzerine ekilirse manipüle etmek için daha erişilebilirdir.
  3. 10 μL 2x PBS ekleyin. PBS çözeltisini ucu kullanarak hafifçe karıştırın. Jellerin en az 20 dakika stabilize olmasına izin verin ve damlacıkların neredeyse sağlam kalmasını sağlayın.
    NOT: PBS ilavesinin ve nazik karıştırmanın amacı, damlacığın bütünlüğünü korumak ve hidrojelin bir tabaka halinde yayılmasını önlemektir.
  4. SW1222 hücrelerini% 0.125 tripsin-EDTA çözeltisi (5 mL) kullanarak ayırın. Hücreleri tripsin ile 37 ° C'de şişeden ayrılana kadar 5-10 dakika inkübe edin. Hücre topaklanmasını önlemek için şişeye dokunmaktan kaçının.
  5. Tripsini etkisiz hale getirmek için 5 mL tam ortam ekleyin. 30 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak hücre süspansiyonunu filtreleyin. Alternatif olarak, agregaları parçalamak için 25 G iğneli bir şırınga kullanın.
  6. 0.4 × 106 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın ve 10 μL'lik bir mikropipet kullanarak her peptit damlacığına 2 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
  7. Damlacıkları 37 ° C'de,% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra her bir oyuğa 0.5 mL takviye edilmiş ortam ekleyin.
  8. Beklerken, ana stoğu (partiye bağlı olarak 8-12 mg/mL) takviye edilen ortamı kullanarak 3 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyrelterek bazal membran matris kontrolünü hazırlayın. Bu çözeltiye hücreler ekleyin (25 μL başına 800 hücre).
    NOT: Bazal membran manipülasyonu her zaman buz üzerinde yapılmalıdır. Hidrojele dokunmadan önce uçlar buz gibi soğuk PBS'de durulanmalıdır. Aksi takdirde, uçların içinde polimerizasyon meydana gelecektir.
  9. Her kuyucukta 20 μL bazal membran çözeltisi damlacıkları levha. 37 °C'de 20 dakika inkübe ederek damlacıkların jelleşmesine izin verin. Malzeme jelleştikten sonra 0,5 mL tam ortam ekleyin.
  10. Ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. Hücrelerin 4. gün gibi erken bir tarihte lümen oluşumu sinyallerini organize ettiğini ve gösterdiğini gözlemleyin.
  11. Organoid büyümesini değerlendirmek için 1. gün, 4. gün ve 7. günde parlak alandaki hücreleri görüntüleyin.

3. Canlılık ve çoğalma

  1. Canlılık testi için üç siyah kuyu plakası ve proliferasyon testi için üç siyah kuyu plakası hazırlayın. Oyuk başına 25 μL 2x peptit çözeltisi ekleyin ve aynı hacimde 2x PBS kullanarak jelleştirin. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi tohumlayın.
  2. Proliferasyon plakasında boşluk olarak kullanılacak her peptit hidrojel formülasyonu için üç kuyucuk hazırlayın. Bunların üzerine hücre tohumlamayın.
  3. Ortamı canlılık kuyusu plakasından çıkarın ve 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  4. Calcein-ve etidyum homodimerini, memeli hücreleri için canlılık / sitotoksisite Kitinden (Malzeme Tablosuna bakınız) aynı ışık korumalı konik tüpe 8 μM'ye seyreltin. Bu çözeltinin 2 mL'sini ışık korumalı bir konik tüpte 2 mL PBS'ye hazırlamak için, 4 μL Calcein-stok çözeltisi ve 8 μL Etidyum homodimer-1 stok çözeltisi ekleyin.
  5. Adım 3.4'te hazırlanan kalsiyum/etidyum homodimer çözeltisini 96 oyuklu plakaya ekleyin. Kuyucuk başına 100 μL ekleyin. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  6. 1x PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın. Floresan mikroskobu altında 4x objektif kullanırken en az üç alan (orta, üst, alt, alt) veya 10x ve 20x objektif kullanırken en az beş alan (orta, sol üst, sağ üst, sol alt, sağ alt) görüntüleyin.
  7. 90 μL'lik bir nihai hacim sağlamak için ortamı proliferasyon kuyusu plakasından çıkarın.
  8. %10'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 10 μL Alamar Blue çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
  9. Işıktan koruyun ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 2-4 saat inkübe edin
  10. Floresan (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) veya absorbansı (570 nm) ölçmek için bir kuyu plakası okuyucu kullanın. Boşluklar için elde edilen değerlerin ortalamasını alın ve bunları hücre içeren her bir kuyucuktan elde edilen değerlerden çıkarın.
  11. Her koşulun sinyalinin ortalamasını alarak ve ilgili boşluklarının ortalamasını çıkararak proliferasyon değerlerini hesaplayın. Zamana karşı bağıl absorbans/floresan sinyalinin indekslenmiş bir kutu grafiği oluşturarak grafikler oluşturun.

4. Hücrelerin matrise yapışma deneyi

  1. İki bağımsız 96 oyuklu plakada 100 μL peptit hidrojel hazırlayın.
  2. Her oyuğa 20.000 hücre tohumlayın ve 100 μL ortam ekleyin. Plakaları 37 ° C'de,% 5 CO2'de 90 dakika inkübe edin.
  3. İnkübasyondan sonra, sadece bir plaka alın ve 20-30 saniye boyunca bir P200 mikropipet kullanarak ortamı dikkatlice yeniden süspanse edin. Ucu jelden uzak tutarak hidrojeli bozmamaya dikkat edin. Alternatif olarak, hidrojel mekanik özellikleri buna izin veriyorsa (G' > 8.000 Pa), hareketli bir girdap kullanarak kuyu plakasının dört tarafına hafifçe vurun.
    NOT: Ortamın yeniden askıya alınması (veya girdapla kuyucuk plakasına vurulması), hem bağlanmamış hücreleri hem de matrisin yüzeyine zayıf yapışma olan hücreleri çıkaracaktır. Hücresel bağlanma 90 dakika içinde gerçekleşecektir, ancak bu bağlanmanın gücü spesifik peptit hidrojellerine ve bunların yapışkan ve bağlayıcı özelliklerine bağlı olarak değişecektir. Kolorektal organoid büyümesinin, sertlik değerleri 2.000 Pa'nın altında olan matrislerde tercih edildiği bilinmektedir. Bu nedenle, bu protokolde sunulan hidrojeller yumuşak ve kırılgan olduğundan, hafif mekanik stres kullanmaya özen gösteriyoruz.
  4. Her iki kuyucuk plakasından 100 μL ortamı çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  5. 1 μg / mL DAPI çözeltisi hazırlayın. Tüm kuyucuklara 100 μL DAPI çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  6. Bir floresan mikroskobu altında temsili bir dizi alanı görüntüleyin. Piksel/mesafe oranını sabit tutmak için tüm görüntülerin aynı amaç kullanılarak elde edildiğinden emin olun.
    NOT: 10x hedef için dokuz alanı veya 20x hedef için 15 alanı görüntüleyin.
  7. Floresan görüntülerini görüntü analiz yazılımına (örn. ImageJ) yükleyin ve tüm görüntülerdeki parçacıkları analiz edin.
    1. Image (Görüntü) menüsünden Type (Tür) seçeneğini belirleyin ve 8 bit'e tıklayın.
    2. Görüntü menüsünden Ayarla'yı seçin ve Parlaklık/Kontrast'a tıklayın. Otomatik düğmesine tıklayın | Uygula'yı tıklayın.
    3. Image (Görüntü) menüsünden Adjust (Ayarla) seçeneğini seçin ve Threshold (Eşik) üzerine tıklayın. Otomatik düğmesine tıklayın ve pencereyi kapatın.
    4. Analiz menüsünden, Parçacıkları Analiz Et'e tıklayın. Özetleme seçeneğini işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın.
    5. Özet penceresinde, Dosya menüsünün üzerine gelin ve özet değerleri kaydetmek için Kaydet'e tıklayın.
  8. Tüm görüntülerin sonuçlarını standart istatistik yazılımına aktarın.
  9. Stresten önce ve sonra hücrelerin kapladığı alanın yüzdesini hesaplayın. Her koşula karşı alan yüzdesinin dizinlenmiş bir kutu grafiğini oluşturun.

5. Peptit hidrojeldeki organoidlerin immün boyaması

  1. Adım 2.1-2.10'da açıklandığı gibi 4 gün boyunca 20 μL peptit hidrojel damlacıkları içinde 800 hücre tohumlayın.
  2. 4. günde, ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu 1x PBS kullanarak 2x yıkayın.
  3. 400 μL% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin. Kuyu plakasını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  4. Formaldehit çözeltisini bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  5. 1 mL geçirgenlik tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  6. Geçirgenlik tamponunu bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  7. 0,5 mL bloke edici tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  8. Engelleme tamponunu bir P1000 ile çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın.
  9. Bloke edici tampondaki birincil antikoru üreticinin talimatlarına göre seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). İki kuyucuğa 200 μL ekleyin.
  10. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  11. Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  12. İkincil antikoru, üreticinin talimatlarına göre bloke edici tamponda seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). İkincil antikor çözeltisine 1:40 oranında falloidin konjugatını ekleyin.
  13. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında en fazla 3 saat inkübe edin. Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  14. Bloke edici tamponda 1 μg / mL'lik bir DAPI çözeltisi hazırlayın. Her kuyucuğa 300 μL DAPI çözeltisi ekleyin.
  15. Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  16. Boyama solüsyonunu bir P200 ile çıkarın ve 1x PBS ile bir kez yıkayın.
  17. Işıktan koruyun ve 4 °C'de 7 güne kadar saklayın.

6. Matriksteki organoidlerin görüntülenmesi ve görüntü analizi

  1. Lekeli numuneleri 10x'te bir epifloresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Sadece phalloidin ve DAPI kanallarını kullanın.
  2. Cellopose yazılımını açın ve bir görüntü yüklemek için ctrl + L tuşlarına basın. Yazılım, seçilen görüntünün konumundaki tüm dosyalara erişebileceğinden, tüm floresan görüntüleri herhangi bir alt klasör olmadan tam konuma kaydettiğinizden emin olun.
  3. Segmentasyon paneline kolonilerin ortalama çapını yazın ve ENTER'ı tıklatın.
  4. Kolon organoidleri için özel bir model seçin ve Modeli Çalıştır düğmesine tıklayın.
    NOT: Burada, Cellpose2.0 29,30'da sıfırdan iki model kullanmanızı öneririz.
  5. Maskeleri .npy dosyası olarak kaydetmek için ctrl + s tuşlarına basın.
  6. Klasörün görüntüleri arasında hareket etmek için klavye oklarını kullanın ve klasördeki tüm görüntülerde iki nokta üst üste organoidleri modelini çalıştırın.
  7. Klasörün bir kopyasını alın ve kolon organoid lümeni için bir model kullanarak 6.2-6.6 adımlarını tekrarlayın.
  8. ImageJ'yi açın ve Eklenti | Makrolar | Koşmak... Cellpose Github sitesinde bulunan imagej_roi_converter.py dosyasını çalıştırmak için ve bir pencerenin görünmesini bekleyin.
  9. İki nokta üst üste organoid klasöründen ilk dosyayı seçin ve Aç'a tıklayın.
  10. İlk dosyaya karşılık gelen seg.npy dosyasını seçin ve Aç'a tıklayın.
    NOT: ImageJ, maskeleri ilgi alanlarına dönüştürecek ve bunları karşılık gelen floresan görüntülerle örtüştürecektir.
  11. ROI Yöneticisi penceresinde Tümünü Seç'e tıklayın ve Ölç'e tıklayın.
  12. Dosya | Farklı kaydet... tıklayın ve sonuçları kaydedin.
    NOT: Bu, alandaki her koloninin tüm şekil özelliklerini içeren bir .csv dosyasıyla sonuçlanacaktır.
  13. Kolon organoid lümen klasöründeki aynı görüntü için 6.8-6.12 arasındaki adımları tekrarlayın.
  14. OriginPro'yu yükleyin ve İçe Aktarma Sihirbazı'nı açmak için ctrl + 3 tuşlarına basın. Üç nokta düğmesine tıklayın ve aynı görüntü için organoid ve lümen şekil özelliklerine karşılık gelen her iki .csv dosyasını da seçin.
  15. Her lümen ölçümünün ilgili koloni ile eşleştirildiğinden emin olmak için lümen şekli özelliklerinden elde edilen sonuçları kopyalayıp koloni sonuçlarının yanındaki bir sütuna yapıştırın.
  16. Yeni bir sütunda, içerdiği koloninin göreli lümen alanını elde etmek için lümen ve koloni alanlarını bölün.
  17. Her koloninin daireselliğine ve lümen alanına karşılık gelen sütunu seçin. Arsa Üzerine Tıklayın | Temel 2D | Dağılım.
  18. Çizim penceresine sağ tıklayın ve Çizim ayrıntıları'nı seçin. Centroid(PRO) sekmesine tıklayın ve Alt Küme için Merkez Noktasını Göster, Veri Noktalarına Bağlan ve Elipsi Göster seçeneklerini işaretleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İlk olarak, 24 oyuklu bir plakada büyütülen hücreleri 7 gün boyunca parlak alan görüntüleme kullanarak değerlendirdik. Şekil 4'te görüldüğü gibi, hafta boyunca organoidlere bir araya gelen küçük hücre kümelerini belirledik. Kontrollü bir tarama yöntemi, hücrelerin ve organoidlerin farklı günler arasındaki hareketliliğini takip edebilir. Genel olarak, tüm hafta boyunca hücrelerin morfolojisinin evrimine baktık. SW1222'den türetilmiş organoidler yuvarlak bir mo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

SAP'lerin biyomedikal araştırmalardaki büyük potansiyeli, biyoişlevselleştirme yoluyla dövülebilirlikleri ve uyarlanabilirlikleri ile vurgulanmaktadır. Bu kadar geniş bir permütasyon dizisiyle, özellikle organoid araştırmalarında, belirli uygulamalar için en umut verici konfigürasyonların verimli bir şekilde test edilmesi ve belirlenmesinde zorluk ortaya çıkmaktadır. Hızlı, uygun maliyetli bir çözüm çok önemlidir. İnsan kolorektal adenokarsinomundan türetilen SW1222 hücre hattı, bu tür y...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından finansal olarak desteklendi. Yazarlar, KAUST'un İnovasyon ve Ekonomik Kalkınma tarafından verilen KAUST'un Tohum Fonu Hibesini ve KAUST'un İnovasyon Fonu'nu kabul eder. Yazarlar, biyolojik karakterizasyon ve mikroskopi analizlerini desteklemek için KAUST'un Biyobilim ve Görüntüleme Çekirdek Laboratuvarlarına teşekkür eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco14190144
6-well plate, tissue culture treatedCorning07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesiumGibco70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo Scientific28906
24-well plate, tissue culture treatedCorning09-761-146
96-well black plate, tissue culture treatedCorning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonalAbcamab40839Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonalAbcamab16505Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonalAbcamab190085Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAObtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633Invitrogen35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cellsInvitrogenL3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red freeCorning356255Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Round Cover Slip, 10 mm diameterVWR631-0170
Scanning Electron MicroscopeThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 μm strainerSysmex04-004-2326
sucroseSigma-AldrichS1888
SW1222 cell lineECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure waterInvitrogen10977015

Referanslar

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
  3. Loo, Y., et al. Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration. Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).
  4. Loo, Y., et al. Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures. Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).
  5. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  6. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  7. Kim, S., et al. Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids. Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).
  8. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  9. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  10. Hauser, C. A., et al. Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).
  11. Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices. Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).
  12. Rauf, S., et al. Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions. Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).
  13. Bilalis, P., et al. Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).
  14. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  15. Moretti, M., et al. Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration. Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).
  16. Alhattab, D. M., et al. Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system. Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).
  17. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  18. Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery. Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).
  19. Yan, Y., et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair. Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).
  20. Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).
  21. Hogrebe, N. J., et al. Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel. Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).
  22. Wu, F. J., Lin, H. C. Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles. Molecules. 27 (13), 4115(2022).
  23. Cringoli, M. C., et al. Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs. Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).
  24. Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis. Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).
  25. Pérez-Pedroza, R., et al. Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink. International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).
  26. Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors. Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).
  27. Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).
  28. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  29. Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).
  30. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  31. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  32. Humphries, M. J. Cell-substrate adhesion assays. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  33. Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration. Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).
  34. Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).
  35. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  36. Matthews, J. M., et al. OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics. PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).
  37. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  38. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).
  39. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).
  40. Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer. Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).
  41. Yadav, N., et al. Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).
  42. Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Kolorektal Kanser OrganoidleriSW1222 H cre HattUltra K sa Kendili inden Birle en Peptit MatrisiHidrojellerH cre D MatriksH cre Matriks Etkile imleriH cre AdhezyonuL men Olu umumm n BoyamaFloresan G r nt Analizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır