Ultra Kısa Kendi Kendine Birleşen Peptit Matrisinde SW1222 Hücre Hattından Kolorektal Kanser Organoidlerinin İmalatı ve Karakterizasyonu

Özet

Bu protokol, immün boyama ile hücre adezyonu, organoid morfolojisi ve gen ekspresyonu için biyofonksiyonel kendi kendine birleşen peptitleri değerlendirmeyi amaçlar. Yoğun testler için organoidleri elde etmenin uygun maliyetli bir yolunu sağlamak için bir kolorektal kanser hücre hattı kullanacağız.

Özet

Ultra kısa kendi kendine birleşen peptitler (SAP'ler) kendiliğinden hücre dışı matrise benzeyen nanofiberler oluşturabilir. Bu lifler, biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilen ve immünojenik olmayan hidrojellerin oluşumuna izin verir. SAP'lerin, protein türevi motiflerle biyoişlevsel hale getirildiğinde, kolorektal organoid oluşumunu destekleyen hücre dışı matris özelliklerini taklit edebileceğini daha önce kanıtlamıştık. Bu biyofonksiyonel peptit hidrojeller, hücre-matris etkileşimlerinin hücre yapışmasını artırmasına izin veren ipuçlarını içerirken, orijinal ana peptitin mekanik özelliklerini, ayarlanabilirliğini ve yazdırılabilirliğini korur. Bu makale, kolorektal kanser organoidleri oluşturabilen bir adenokarsinom kanser hücre hattı kullanarak çeşitli biyofonksiyonel peptit hidrojellerin hücre yapışması ve lümen oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmek ve karakterize etmek için gereken protokolleri sunmaktadır. Bu protokoller, immün boyama ve floresan görüntü analizi kullanılarak hücre yapışması ve luminal oluşumu üzerindeki biyofonksiyonel peptit hidrojel etkilerinin değerlendirilmesine yardımcı olacaktır. Bu çalışmada kullanılan hücre dizisi, daha önce hayvan türevli matrislerde organoidler üretmek için kullanılmıştır.

Giriş

Son yıllarda, kendi kendine birleşen peptitler (SAP'ler), doku mühendisliği uygulamaları için umut verici biyomalzemeler olarak ortaya çıkmıştır. SAP'ler, nanoliflerin kendiliğinden oluşumu, biyouyumluluk, biyolojik olarak parçalanabilirlik ve immünojenisite olmama gibi benzersiz özelliklere sahiptir ve bu da onları iskele geliştirme için çekici adaylar haline getirir¹. SAP'ler daha önce çeşitli hücre tipleri ile birlikte kullanılmıştır ve özellikle, bildirilen ultra kısa SAP'ler, 30'dan fazla geçişi kapsayan ve minimum kromozomal anormallik insidansı ile uzun süreler boyunca pluripotentliklerini korurken kök hücrelerin ka....

Protokol

1. Tampon ve çözelti hazırlama

NOT: Belirtilen tüm konsantrasyonlar nihai konsantrasyonlardır.

1. Tam Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unu (IMDM) hazırlamak için sırasıyla% 10 ve% 1'lik bir nihai konsantrasyonda fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
2. Geçirgenlik tamponunu hazırlamak için MgCl₂ (3 mM), sükroz (300 mM) ve Triton X-100'ü (% 0.5) fosfat tampon salin (PBS) içinde karıştırın. Bu solüsyonu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
3. Bir bloke edici tampon hazırlamak için sığır serum albümini (BSA,% 1), glisin (0.3 M) ve Tween....

Tartışmalar

SAP'lerin biyomedikal araştırmalardaki büyük potansiyeli, biyoişlevselleştirme yoluyla dövülebilirlikleri ve uyarlanabilirlikleri ile vurgulanmaktadır. Bu kadar geniş bir permütasyon dizisiyle, özellikle organoid araştırmalarında, belirli uygulamalar için en umut verici konfigürasyonların verimli bir şekilde test edilmesi ve belirlenmesinde zorluk ortaya çıkmaktadır. Hızlı, uygun maliyetli bir çözüm çok önemlidir. İnsan kolorektal adenokarsinomundan türetilen SW1222 hücre hattı, bu tür y.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015