A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
نظرا لأن البروتوكولات المتعلقة بكريسبر أصبحت مفيدة بشكل متزايد ويمكن الوصول إليها ، فلا يزال من الممكن أن تنشأ المضاعفات والعقبات في ظل ظروف تجريبية محددة. يحدد هذا البروتوكول إنشاء خط خلية بشرية بالضربة القاضية من سيرين / بروتين ثريونين 1 (RIPK1 / RIP1) المتفاعل مع المستقبلات باستخدام CRISPR / Cas9 ويسلط الضوء على التحديات المحتملة التي تمت مواجهتها خلال هذه العملية.
يحدد هذا البروتوكول إجراء لإخراج جين RIP1 باستخدام CRISPR / Cas9 في خط خلية U937 أحادية الخلية البشرية. تستخدم الطريقة بلازميدات الحمض النووي الريبي الموجهة المعينة وبلازميدات التعبئة والتغليف الفيروسية لتحقيق ضربة قاضية لجين RIP1. يعالج البروتوكول التحديات والتحسينات التي تطرأ على طرق كريسبر التقليدية ، مما يتيح تكراره لدراسات موت الخلايا المستقبلية. يمكن استخدام الخلايا الطافرة الناتجة للتحقيق في التغيرات الميكانيكية في موت الخلايا ، حيث تلعب بروتينات RIP1 الوظيفية دورا. أظهرت فحوصات الجدوى انخفاضا كبيرا في موت الخلايا في الخلايا بالضربة القاضية بعد تحريض التشريع. كشف الفحص المجهري الفلوري عن انخفاض ملحوظ في أنواع الأكسجين التفاعلي للميتوكوندريا (ROS) في الخلايا بالضربة القاضية في ظل نفس الظروف. تؤكد هذه المقايسات الوظيفية معا فقدان بروتين RIP1. تم تحسين هذا الإجراء للاستخدام مع الخلايا الوحيدة البشرية U937 ، ويمكن أيضا تكييفه لاستهداف منظمات موت الخلايا الرئيسية الأخرى ، مما ينتج عنه طفرات وظيفية غير قاتلة. تتم معالجة المزالق المحتملة في جميع الأنحاء لتقديم رؤى حول التحديات التي قد تنشأ أثناء توليد الطفر.
يتطور استخدام تقنية تحرير الجينات CRISPR / Cas9 بسرعة منذ اكتشافها1،2،3. إن القدرة على ضرب الجينات أو ضربتها القاضية داخل خطوط الخلايا أو البكتيريا لا تقدر بثمن لتوجيه البحث وفهم الآليات داخل الخلايا1،2،3،4،5،6. يحسن نظام CRISPR-Cas9 طرق تحرير الجينات السابقة ، مثل نوكلياز المستجيب الشبيه بمنشط النسخ (TALEN) ، من خلال تبسيط هندسة خصوصية الجينات. يتضمن هذا الإجراء مكونين أساسيين: دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) المستخدم لتحديد الهدف الجيني المقصود ، و Cas9 ، وهو نوكلياز داخلي يعدل موقع الجينوم المقصودبكسر الحمض النووي المزدوج 3،4. سيعمل gRNA كدليل لنوكيلياز Cas9 لتحديد موقع الكسر المزدوج الشريطة وبدء التسلسل الجيني المقصود من خلال اقتران قاعدة Watson-Crick. تتضمن العملية الكاملة لتحرير الجينوم بواسطة نظام CRISPR / Cas9 الآلات الخلوية التي تصلح هذه الفواصل المزدوجة الشريطة في الحمض النووي من خلال الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) أو إعادة التركيب المتماثل3،7. من المرجح أن يحدث NHEJ ، مما يؤدي بشكل فعال إلى إنشاء طفرة في الجينوم تؤدي إلى فقدان التعبير عن الجين المستهدف3،4.
تمكنت المصادر التجارية من إنشاء مكتبات لأهداف الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي التي يمكن التعبير عنها من خلال نمو البكتيريا وعزلها ، مما يحسن بشكل كبير من سهولة استخدامها. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي لنظام CRISPR / Cas9 هو صعوبة توصيل مركب gRNA و Cas9 إلى خطوط الخلايا المستهدفة. تنشأ هذه القيود في خطوط الخلايا المعلقة ، حيث يشار إليها عموما باسم 8 التي يصعبنقلها. طرق التعدي النموذجية ليست فعالة بشكل عام في توصيل نظام CRISPR / Cas9 إلى خلايا التعليق ، وهذا هو السبب في أن طرق توصيل الفيروس مثل تعداء الفيروسات ونقلها مناسبة بشكل أفضل لهذا النوع من خط الخلايا8،9.
يتطلب هذا النوع من التعدي ناقلا للفيروسات العدسية يقوم بتشفير gRNA و Cas9 endonuclease جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة الفيروسية المضافة ، والتي يتم نقلها إلى خط خلوي قادر على تصنيع جزيئات الفيروسات العسسية. خط الخلايا المختار عادة لهذه العملية هو HEK293T الخلايا ، حيث يسهل نقلها وتعمل بكفاءة عالية في تجميع gRNA و Cas99،10. ثم يتم إطلاق هذه الجسيمات كفيروسات عدسية في المادة الطافية ، والتي يمكن استخدامها لنقل gRNA و Cas9 إلى خط الخلايا المعلقة المقصود ، مثل الخلايا الوحيدة البشرية U937. على هذا النحو ، يحتوي الإجراء الموصوف هنا على التغييرات التالية مقارنة بالطرق المعمول بها: (1) طريقة التعداء البديلة لخطوط الخلايا التي يصعب نقلها. (2) لا حاجة لتركيز الحمض النووي البلازميد كريسبر أو استخدام أجهزة الطرد المركزي الفائقة. و (3) يلغي الحاجة إلى الاستنساخ أحادي الخلية.
كان التركيز المباشر لهذه المقالة هو القضاء على جين RIP1 في الخلايا الوحيدة البشرية U937. يتم التحكم في الشكل الكنسي لتشريح مسار موت الخلايا شديد الالتهابات بواسطة RIP1 ، والذي يعمل كهدف محوري لدراسات موت الخلايا. 11،12،13،14 عندما يصبح RIP1 نشطا من خلال الفسفرة الذاتية ، فإنه يقوم بعد ذلك بتجنيد ويسبب الفسفرة المباشرة وتنشيط كيناز سيرين / بروتين ثريونين المتفاعل مع المستقبلات 3 (RIPK3 / RIP3) والسودوكيناز الشبيه بمجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) لتشكيل النيكروسوم. بعد هذا التكوين ، يكون النيكروسوم حرا في التحرك في جميع أنحاء الخلية للتفاعل مع العضيات مثل الميتوكوندريا12،13. في الميتوكوندريا ، يعمل RIP1 على تحفيز حلقة التغذية الراجعة الإيجابية مع التمثيل الغذائي الخلوي ، مما يؤثر بشكل مباشر على إنتاج ROS للميتوكوندريا ، والذي بدوره يعزز المزيد من الفسفرة الذاتية ل RIP1 ، وتكوين النيكروسوم ، والتنفيذ النهائي لداء التشريح11،12،13،14.
في حين أن تركيز مجموعة البحث الحالية ينصب على دور RIP1 في موت الخلايا ، فإن الأسباب الأخرى لدراسة RIP1 تشمل أدواره في الالتهاب والعدوى. عند التنشيط بواسطة مستقبلات الموت مثل مستقبلات TNF ، يعزز RIP1 تنشيط مسار إشارات NF-κB ، مما يؤدي إلى نسخ السيتوكينات المؤيدة للالتهابات والكيموكينات والجزيئات الأخرى الضرورية لتجنيد الخلايا المناعية وتضخيم الاستجابة الالتهابية15. بالإضافة إلى تنشيط NF-κB ، يمكن ل RIPK1 أيضا إشراك مسارات إشارات MAPK ، مما يزيد من تعزيز الالتهاب15،16. فيما يتعلق بدوره في الاستجابات للعدوى ، يعمل RIP1 كوسيط محوري للاستجابة الالتهابية للمضيف ، لا سيما في الاستجابة للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) المعترف بها بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) مثل المستقبلات الشبيهة بالحصيلة (TLRs) 17. علاوة على ذلك ، أثناء تعفن الدم ، يتم تنشيط RIP1 عن طريق إرسال إشارات من خلال مستقبلات الموت مثل مستقبلات عامل نخر الورم ، مما يؤدي إلى بدء شلالات مؤيدة للالتهابات. يتوسط RIPK1 في تنشيط مسارات NF-κB و MAPK ، مما يعزز إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل TNF-α و IL-1β و IL-6 ، والتي تعد محركات رئيسية للاستجابة الالتهابية الجهازية المميزة للتعفنالدموي 18.
يتم توفير تمثيل تخطيطي للإجراء في الشكل 1. دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) والتسلسل المستهدف مذكور في الجدول 1. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. حصاد ناقلات التعبير الفيروسي RIP1 التي تستهدف CRISPR gRNA التي تحتوي على نوكلياز داخلي Cas9 ومقاومة البيرومايسين من الإشريكية القولونية
2. تعداء الخلايا HEK293T باستخدام ناقل التعبير الفيروسي المنقى CRISPR gRNA الذي يستهدف RIP1
3. نقل الفيروسات العدسية لخلايا U937 أو الخلايا المستهدفة
4. اختبار فعالية البروتوكول المكتمل في إنشاء خلايا RIP1 CRISPR الطافرة باستخدام تحليل اللطخة الغربية
بعد إنتاج مجموعة متجمعة من خلايا U937 الطافرة RIP1 CRISPR ، تم إجراء تحليل SDS-PAGE و Western blot. تم استخدام تحليل اللطخة الغربية لتحديد الإنشاء الناجح لخط الخلايا الطافرة RIP1 CRISPR من خلال تقييم فقدان مستويات التعبير عن بروتين RIP1. تم إجراء هذا القرار بناء على النتيجة المقارنة ل?...
يهدف هذا البروتوكول إلى توفير تعليمات وتحليل مفصل للمزالق المحتملة في كفاءة وموثوقية تعدين الفيروسات العدسية ونقلها لإنشاء خط خلية RIP1 بالضربة القاضية U937. على الرغم من أن طريقة التعدين والتحويل هذه تتطلب عمالة ووقتا طويلا ، إلا أنها تعتبر عموما طريقة فعالة لدمج gRNA ?...
اي.
تم تمويل هذا البحث من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (NHLBI) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) ، رقم المنحة NIH 2R15-HL135675-02 إلى T.J.L.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adjusted DMEM Medium | Gibco | 11995-040 | |
Ampicillin | Sigma | A1593 | |
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride | Sigma | B2261 | |
Complete RPMI-1640 Medium | Sigma | R6504 | |
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain | transOMIC | TELA1011 | |
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain | transOMIC | TEVH-1162203 | |
End-over-end Rotator | Thermo Scientific | ||
EVOS FL Fluorescence Microscope | Life Technologies | ||
GenElute Plasmid Maxiprep Kit | Sigma | PLX15 | |
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate | Sigma | AP307P | |
HEK293T Cells | ATCC | ||
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | ||
LB Agar | BD | 244520 | |
LB Broth | BD | 244610 | |
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix | Gibco | A43237 | |
MitoSOX Red | MedChemExpress | HY-D1055 | |
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
Necrostatin-1 | MedChemExpress | HY-14622A | |
OPTI-MEM | Gibco | 31985-062 | |
Puromycin | Sigma | P7255 | |
Rabbit anti-human RIP1 mAb | Cell Signaling Technology | 3493 | |
SDS-PAGE and western blot equipment | BioRad | ||
TNF-α | MedChemExpress | HY-P7058 | |
U937 Human Monocytes | ATCC | ||
WST-1 Cell Proliferation Assay System | TaKaRa | MK400 | |
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent | Roche Diagnostics | 6365779001 | |
z-VAD-FMK | APExBIO | A1902 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved