CRISPR-Cas1 Sistemini Kullanarak Bir RIP937 Nakavt U9 Hücre Hattının Oluşturulması

Özet

CRISPR ile ilgili protokoller giderek daha kullanışlı ve erişilebilir hale geldikçe, belirli deneysel koşullar altında komplikasyonlar ve engeller hala ortaya çıkabilir. Bu protokol, CRISPR/Cas9 kullanarak reseptörle etkileşime giren bir serin/treonin-protein kinaz 1 (RIPK1/RIP1) nakavt insan hücre hattının oluşturulmasını ana hatlarıyla belirtir ve bu işlem sırasında karşılaşılan potansiyel zorlukları vurgular.

Özet

Bu protokol, insan monosit U937 hücre hattında CRISPR/Cas9 kullanarak RIP1 genini devre dışı bırakmak için bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir. Yöntem, RIP1 geninin nakavt edilmesini sağlamak için belirlenmiş kılavuz RNA plazmitlerini ve lentiviral paketleme plazmitlerini kullanır. Protokol, geleneksel CRISPR yöntemlerindeki zorlukları ve iyileştirmeleri ele alarak gelecekteki hücre ölümü çalışmaları için replikasyonunu mümkün kılıyor. Elde edilen mutant hücreler, fonksiyonel RIP1 proteinlerinin aksi takdirde rol oynayacağı hücre ölümündeki mekanik değişiklikleri araştırmak için kullanılabilir. Canlılık deneyleri, nekrotoz indüksiyonunu takiben nakavt hücrelerinde hücre ölümünde önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Floresan mikroskobu, aynı koşullar altında nakavt hücrelerinde mitokondriyal reaktif oksijen türlerinde (ROS) belirgin bir azalma olduğunu ortaya koydu. Birlikte, bu fonksiyonel testler RIP1 proteininin kaybını doğrular. U937 insan monositleri ile kullanım için optimize edilmiş olan bu prosedür, işlevsel, ölümcül olmayan mutantlar veren diğer anahtar hücre ölüm düzenleyicilerini hedeflemek için de uyarlanabilir. Mutant üretimi sırasında ortaya çıkabilecek zorluklara ilişkin içgörüler sağlamak için potansiyel tuzaklar baştan sona ele alınmaktadır.

Giriş

CRISPR / Cas9 gen düzenleme teknolojisinin kullanımı,^{keşfinden bu} yana hızla gelişmektedir ^1,2,3. Hücre dizileri veya bakteriler içindeki genleri nakavt etme veya devre dışı bırakma yeteneği, araştırmaları ilerletmek ve hücre içi mekanizmaların anlaşılması için paha biçilmezdir 1,2,3,4,5,6. CRISPR-Cas9 sistemi, gen özgüllüğü mühendisliğini basitleştirerek, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleaz (TALEN) gibi önceki gen düzenleme yöntemlerini geliştirir. Bu prosedür iki temel bileşen içerir: amaçlanan gen hedefini bulmak için kullanılan kılavuz RNA (gRNA) ve amaçlanan genom konumunu çift sarmallı bir DNA kırılması ^3,4 ile değiştiren bir endonükleaz olan Cas9. gRNA, Cas9 endonükleazının Watson-Crick baz eşleşmesi yoluyla amaçlanan genetik dizide çift sarmallı kırılmayı bulması ve başlatması için bir kılavuz görevi görecektir. CRISPR/Cas9 sistemi tarafından tam genom düzenleme süreci, DNA'daki bu çift sarmallı kırılmaları homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolog rekombinasyon ^3,7 yoluyla onaran hücresel mekanizmayı içerir. NHEJ'nin ortaya çıkması daha olasıdır ve genomda hedef gen ^3,4 için ekspresyon kaybıyla sonuçlanan etkili bir mutasyon oluşturur.

Ticari kaynaklar, bakteri üremesi ve izolasyonu yoluyla ifade edilebilen gRNA hedefleri kütüphaneleri oluşturabilmiştir ve bu da kullanım kolaylıklarını önemli ölçüde artırır. Bununla birlikte, CRISPR / Cas9 sisteminin ana sınırlaması, gRNA ve Cas9 kompleksinin hedef hücre hatlarına iletilmesindeki zorluktur. Bu sınırlamalar, genellikle transfekte edilmesi zor⁸ olarak adlandırıldıkları için süspansiyon hücre hatlarında ortaya çıkar. Tipik transfeksiyon yöntemleri, CRISPR / Cas9 sistemini süspansiyon hücrelerine iletmede genellikle verimli değildir, bu nedenle lentiviral transfeksiyon ve transdüksiyon gibi viral dağıtım yöntemleri bu tip hücre hattı ^8,9 için daha uygundur.

Bu tip transfeksiyon, gRNA ve Cas9 endonükleazını kodlayan bir lentiviral vektör ve lentiviral partiküller üretebilen bir hücre hattına transfekte edilen ilave lentiviral ambalaj plazmitleri gerektirir. Bu işlem için tipik olarak seçilen bir hücre hattı, gRNA ve Cas9 ^9,10'un montajında transfekte etmeleri ve çok verimli çalışmaları daha kolay olduğu için HEK293T hücrelerdir. Bu parçacıklar daha sonra lentivirüsler olarak süpernatana salınır, bu da gRNA ve Cas9'u U937 insan monositleri gibi amaçlanan süspansiyon hücre hattına dönüştürmek için kullanılabilir. Bu nedenle, burada açıklanan prosedür, yerleşik yöntemlere kıyasla aşağıdaki değişikliklere sahiptir: (1) Transfekte edilmesi zor hücre hatları için alternatif transfeksiyon yöntemi; (2) CRISPR plazmid DNA'sını konsantre etmeye veya ultrasantrifüj kullanmaya gerek yoktur; ve (3) Tek hücreli klonlama ihtiyacını ortadan kaldırır.

Bu makalenin doğrudan odak noktası, U937 insan monositlerinde RIP1 genini devre dışı bırakmaktı. Yüksek derecede inflamatuar hücre ölüm yolu nekrotozunun kanonik formu, hücre ölümü çalışmaları için çok önemli bir hedef olarak hizmet eden RIP1 tarafından kontrol edilir. 11,12,13,14 RIP1 otofosforilasyon yoluyla aktif hale geldikçe, nekrozomu oluşturmak için reseptör etkileşimli serin/treonin-protein kinaz 3 (RIPK3/RIP3) ve karışık soy kinaz alanı benzeri (MLKL) psödokinazın doğrudan fosforilasyonuna ve aktivasyonuna neden olur. Bu oluşumu takiben nekrozom, mitokondri^12,13 gibi organellerle etkileşime girmek için hücre boyunca hareket etmekte serbesttir. Mitokondride, RIP1, hücresel metabolizma ile pozitif bir geri besleme döngüsünü güçlendirir, mitokondriyal ROS üretimini doğrudan etkiler, bu da RIP1'in daha fazla otofosforilasyonunu, nekrozom oluşumunu ve nekrotozun aşağı akış yürütülmesini teşvik^eder 11,12,13,14.

Mevcut araştırma grubunun odak noktası RIP1'in hücre ölümündeki rolü olsa da, RIP1'i incelemenin diğer nedenleri arasında iltihaplanma ve enfeksiyondaki rolleri yer almaktadır. TNF reseptörleri gibi ölüm reseptörleri tarafından aktivasyon üzerine, RIP1, proinflamatuar sitokinlerin, kemokinlerin ve immün hücre alımı için gerekli olan diğer moleküllerin transkripsiyonunu ve inflamatuar yanıtın amplifikasyonunu tetikleyen NF-κB sinyal yolunun aktivasyonunu teşvik eder¹⁵. NF-κB aktivasyonuna ek olarak, RIPK1 ayrıca MAPK sinyal yollarını devreye sokarak iltihabı daha da artırabilir^15,16. Enfeksiyona verilen yanıtlardaki rolü ile ilgili olarak, RIP1, özellikle Toll benzeri reseptörler (TLR'ler) gibi örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından tanınan patojenle ilişkili moleküler modellere (PAMP'ler) yanıt olarak, konakçı inflamatuar yanıtının önemli bir aracısı olarak işlev ^görür17. Ayrıca, sepsis sırasında, RIP1, TNF reseptörü gibi ölüm reseptörleri aracılığıyla sinyal göndererek aktive edilir ve bu da pro-inflamatuar kaskadların başlamasına yol açar. RIPK1, sepsis^18'in sistemik inflamatuar yanıt karakteristiğinin temel itici güçleri olan TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi pro-inflamatuar sitokinlerin üretimini teşvik ederek NF-κB ve MAPK yollarının aktivasyonuna aracılık eder.

Protokol

Prosedürün şematik bir gösterimi Şekil 1'de verilmiştir. Kılavuz RNA (gRNA) ve hedef dizi Tablo 1'de verilmiştir. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Escherichia coli'den Cas9 endonükleaz ve puromisin direnci içeren RIP1 hedefli CRISPR gRNA lentiviral ekspresyon vektörünün toplanması

1. 100 μg/mL Ampisilinile desteklenmiş LB agar plakalarına lentiviral vektör gRNA'yı barındıran çeyrek çizgili E. coli.
2. Plakaları 37 ° C'de 1-2 gün boyunca, plakanın en seyreltik bölgesinde tek tek koloniler görünene kadar inkübe edin.
3. Steril bir döngüye sahip tek bir koloni seçin ve her koloniyi 50 mL'lik konik bir tüpe 100 μg/mL Ampisilin ile desteklenmiş 5 mL LB suyuna ayrı ayrı ekleyin. Homojenizasyonu sağlamak için tek koloniyi ekledikten sonra yukarı ve aşağı iyice pipetlediğinizden emin olun.
4. 50 mL konik tüpün kapağını havalandırın ve bantlayın ve 8 saat boyunca 37 ° C ve 225 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
5. 37 ° C'de 8 saatlik inkübasyon sırasında, dört ayrı 50 mL konik tüpün her birine 100 μg / mL Ampisilin ile desteklenmiş 40 mL LB suyu ekleyin.
6. 37 ° C'de 8 saatlik inkübasyonun ardından, 40 μL yetişkin E alın. koli kültürü ve dört 50 mL konik tüpün tümüne ekleyin.
7. 50 mL'lik konik tüplerin kapaklarını havalandırın ve bantlayın ve 37°C ve 225 rpm'de 12-16 saat boyunca bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
8. 37 ° C'deki bu inkübasyonun ardından, büyüyen E. coli bakterilerini peletlemek için tüm tüpleri sallanan bir kova rotorunda 3220 x g'da 20 dakika döndürün.
9. Süpernatanları bir atık behere boşaltın, ardından dört peletin tümünü 100 μg/mL Ampisilin ile desteklenmiş 10 mL LB suyunda birleştirin.
10. Tekil bir pelet elde etmek için birleşik peletleri sallanan bir kova rotorunda 20 dakika boyunca maksimum hızda tekrar döndürün.
11. Mümkün olduğu kadar çok süpernatantı atık behere atın ve aşağıdaki seçeneklerden biriyle devam edin: (1) Islak peleti 1 aya kadar -80°C'de olduğu gibi dondurun. (2) Lentiviral vektör plazmit saflaştırmasına devam edin.
    NOT: Seçenek 1 seçilirse, protokol burada duraklatılabilir.

2. RIP1'i hedefleyen saflaştırılmış CRISPR gRNA lentiviral ekspresyon vektörü ile HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu

1. Tohum HEK293T hücreleri, gece boyunca 3 × 10⁶ ila 5 × 10⁶ hücreli bir konsantrasyonda, 4.5 g / L D-glikoz, L-glutamin, 110 mg / L sodyum piruvat ve% 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS içeren DMEM içeren 10 cm'lik bir plakaya koyun.
2. Ertesi gün, plakaların yaklaşık% 70 -% 90 birleşim özelliğine sahip olduğundan emin olun, ardından protokole devam edin.
3. Transfeksiyon reaktifini 3: 1 oranında (3 kısım reaktif: 1 kısım plazmid DNA) kullanarak 1: 1: 1: 1 oranında plazmit (deneysel CRISPR plazmit: pLP1: pLP2: pLP / VSVG) ile hücrelerin transfeksiyonunu ayarlayın (3 kısım reaktif: 1 kısım plazmit DNA), indirgenmiş serum ortamı ile birlikte.
   NOT: Oranın pLP1: pLP2: pLP/VSVG kısmı bir lentiviral ambalaj karışımıdır.
   1. Transfeksiyon kurulumundan önce transfeksiyon reaktifini, indirgenmiş serum ortamını, CRISPR plazmid DNA'sını ve lentiviral ambalaj karışımını oda sıcaklığına dengeleyin.
   2. 75 μL transfeksiyon reaktifi, 2500 μL indirgenmiş serum ortamı ve 25 μg toplam DNA'yı karıştırın (CRISPR plazmit DNA için spektrofotometre analizine ve lentiviral ambalaj karışımı ile 1: 1: 1: 1 oranına dayalı hesaplama).
   3. Bu karışımın oda sıcaklığında 15-30 dakika inkübe etmesine izin verin. Bu karışımın tüm hacmini birleşen HEK293T hücre plakasına dikkatlice doğrudan ortamın içine pipetleyin (ortamı değiştirmeye gerek yoktur).
4. Transfeksiyon karışımının ve plaka ortamının yeterli homojenizasyonunu sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Plakayı 37 °C'de 48 saat inkübe edin.

3. U937 hücrelerinin veya hedef hücrelerin lentiviral transdüksiyonu

1. 37 ^{° C'de} 48 saatlik inkübasyon tamamlandıktan sonra, ortamı üreticiden HEK293T hücre plakasından 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
2. Kalan HEK293T hücrelerini peletlemek için hacmi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Peletlenmiş HEK293T hücrelerini rahatsız etmemeye dikkat ederek virüs içeren tüm süpernatanı çıkarın ve ayrı bir 15 mL konik tüpte tutun. Ardından, pelet içeren tüpü dekontamine edin ve uygun biyolojik tehlike atık kabına atın.
   NOT: HIV bazlı lentivirüs süpernatanları -80 ° C'de saklanabilir; Bununla birlikte, bunu yapmak, ilk donma/çözülme döngüsünden sonra %55'e varan virüs stabilitesi kaybı riski taşır¹⁹.
3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'da uygun bir hacimde santrifüj ederek 15 mL'lik bir konik tüpte 2 ×^{10 6} U937 hücreli bir pelet sayın ve elde edin ve süpernatanı boşaltın, hücre peletini tüpte bırakın.
4. U937 hücre peletini tüm virüs içeren süpernatan ile yeniden süspanse edin ve ardından tüpü 60 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin.
5. Santrifüjlemeyi takiben, zaten tüpte bulunan virüs içeren süpernatan ile peleti yeniden süspanse etmek için bir pipet kullanın.
6. Tüpü 60 dakika boyunca uçtan uca döndürücüye (veya benzer bir döner cihaza) yerleştirin.
   1. Bu inkübasyonun ardından, hücreleri peletlemek için tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
   2. Hücre peletini, hem virüs içeren süpernatanların hem de %10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ile desteklenmiş tam RPMI-1640 ortamının 1:1 oranlı bir ortam karışımıyla yeniden süspanse edin.
7. Hücre karışımını 10 cm'lik bir doku kültürü plakasına aktarın ve 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
8. Bu inkübasyonu takiben, U937 hücrelerini 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
   1. Peletleri% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS ve 5 μg / mL puromisin ile desteklenmiş tam RPMI-1640 ortamı ile yeniden süspanse edin ve hücreleri bir T25 şişesine aktarın.
   2. Hücreleri 2-3 hafta boyunca el değmeden 37 ° C'de inkübe edin ve hücre büyümesi belirtileri için her 1-2 günde bir kontrol ettiğinizden emin olun.
      NOT: Hücreler birleştiğinde ve ilk geçişi takiben sağlıklı bir devir süresine sahip olduklarında, tamamlanan protokolün etkinliği açısından test edilebilirler.

4. Western blot analizi kullanılarak RIP1 CRISPR mutant hücrelerinin oluşturulmasında tamamlanan protokolün etkinliğinin test edilmesi

1. Yabani tip (WT) U937 monositlerinin, hedeflemeyen kontrol (NTC) CRISPR hücrelerinin ve RIP1 CRISPR mutant hücrelerinin hücresel protein lizatlarını oluşturun 11,12,13.
2. Bu lizatları bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın ve Western blot analizi¹⁴ ile devam edin.
   1. Numuneleri önce bir temizlik proteinine normalleştirin.
   2. Normalleştirmeyi takiben, bir RIP1 CRISPR mutant hücre hattı¹⁴ oluşturmanın başarısını yeterince belirlemek için numuneleri RIP1 protein ekspresyon seviyeleri için analiz edin.
3. Western blot analizi konformasyonunu takiben, hücreler deney amaçlı kullanılabilir.

Sonuçlar

RIP1 CRISPR mutant U937 hücrelerinin birleşik bir popülasyonunun üretimini takiben, SDS-PAGE ve Western blot analizi yapıldı. Western blot analizi, RIP1 protein ekspresyon seviyelerinin kaybını değerlendirerek bir RIP1 CRISPR mutant hücre hattının başarılı bir şekilde oluşturulmasını belirlemek için kullanıldı. Bu belirleme, WT U937 monositleri ve NTC hücrelerinin karşılaştırmalı sonucuna dayanarak yapılmıştır. Şekil...

Tartışmalar

Bu protokol, bir RIP1 nakavt U937 hücre hattı oluşturmak için lentiviral transfeksiyon ve transdüksiyonun verimliliği ve güvenilirliğindeki potansiyel tuzakların ayrıntılı talimatını ve analizini sağlamayı amaçlamaktadır. Bu transfeksiyon ve transdüksiyon yöntemi emek ve zaman yoğun olmasına rağmen, genellikle seçilen gRNA ve Cas9 endonükleazını transfekte edilmesi zor hücre hatlarına dahil etmenin etkili bir yolu olarak kabul edilir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902