Generación de una línea celular RIP1 knockout U937 utilizando el sistema CRISPR-Cas9

Resumen

A medida que los protocolos relacionados con CRISPR se vuelven cada vez más útiles y accesibles, aún pueden surgir complicaciones y obstáculos en condiciones experimentales específicas. Este protocolo describe la creación de una línea celular humana knockout de serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK1/RIP1) que interactúa con el receptor utilizando CRISPR/Cas9 y destaca los posibles desafíos encontrados durante este proceso.

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento para eliminar el gen RIP1 utilizando CRISPR/Cas9 en la línea celular de monocitos humanos U937. El método utiliza plásmidos de ARN guía designados y plásmidos de empaquetamiento lentiviral para lograr la eliminación del gen RIP1. El protocolo aborda los desafíos y las mejoras de los métodos tradicionales de CRISPR, lo que permite su replicación para futuros estudios de muerte celular. Las células mutantes resultantes se pueden utilizar para investigar cambios mecanicistas en la muerte celular, donde las proteínas RIP1 funcionales desempeñarían un papel. Los ensayos de viabilidad demostraron una reducción significativa de la muerte celular en las células knockout después de la inducción de la necroptosis. La microscopía de fluorescencia reveló una marcada disminución de las especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales en las células knockout en las mismas condiciones. En conjunto, estos ensayos funcionales confirman la pérdida de la proteína RIP1. Optimizado para su uso con monocitos humanos U937, este procedimiento también puede adaptarse para dirigirse a otros reguladores clave de la muerte celular, produciendo mutantes funcionales y no letales. Los posibles escollos se abordan a lo largo de todo el libro para proporcionar información sobre los desafíos que pueden surgir durante la generación de mutantes.

Introducción

El uso de la tecnología de edición genética CRISPR/Cas9 ha evolucionado rápidamente desde su descubrimiento ^1,2,3. La capacidad de knock-in o knock-out genes dentro de líneas celulares o bacterias es invaluable para avanzar en la investigación y la comprensión de los mecanismos intracelulares 1,2,3,4,5,6. El sistema CRISPR-Cas9 mejora los métodos de edición de genes anteriores, como la nucleasa efectora similar a un activador de transcripción (TALEN), al simplificar la ingeniería de la especificidad de los genes. Este procedimiento incluye dos componentes fundamentales: el ARN guía (ARNg) utilizado para localizar la diana génica prevista, y Cas9, que es una endonucleasa que modifica la localización del genoma prevista con una rotura de ADN bicatenario ^3,4. El ARNg actuará como guía para que la endonucleasa Cas9 localice e inicie la ruptura de doble cadena en la secuencia genética prevista a través del emparejamiento de bases Watson-Crick. El proceso completo de edición del genoma por el sistema CRISPR/Cas9 involucra maquinaria celular que repara estas roturas de doble cadena en el ADN a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la recombinación homóloga ^3,7. Es más probable que ocurra NHEJ, creando efectivamente una mutación en el genoma que resulta en una pérdida de expresión para el gen objetivo ^3,4.

Las fuentes comerciales han sido capaces de crear bibliotecas de dianas de ARNg que pueden expresarse a través del crecimiento y el aislamiento bacteriano, lo que mejora significativamente su facilidad de uso. Sin embargo, la principal limitación del sistema CRISPR/Cas9 es la dificultad para administrar el ARNg y el complejo Cas9 en las líneas celulares objetivo. Estas limitaciones surgen en las líneas celulares en suspensión, ya que generalmente se las conoce como difíciles de transfectar⁸. Los métodos de transfección típicos no suelen ser eficientes para administrar el sistema CRISPR/Cas9 a las células en suspensión, por lo que los métodos de administración viral como la transfección lentiviral y la transducción son más adecuados para este tipo de línea celular ^8,9.

Este tipo de transfección requiere un vector lentiviral que codifique el ARNg y la endonucleasa Cas9 junto con plásmidos de empaquetamiento lentiviral agregados, que se transfectan en una línea celular que es capaz de fabricar partículas lentivirales. Una línea celular típicamente elegida para este proceso son las células HEK293T, ya que son más fáciles de transfectar y trabajan de manera muy eficiente en el ensamblaje de ARNg y Cas9 ^9,10. A continuación, estas partículas se liberan como lentivirus en el sobrenadante, que puede utilizarse para transducir el ARNg y el Cas9 en la línea celular de suspensión prevista, como los monocitos humanos U937. Como tal, el procedimiento descrito aquí tiene los siguientes cambios en comparación con los métodos establecidos: (1) Método de transfección alternativo para líneas celulares difíciles de transfectar; (2) No es necesario concentrar el ADN plasmídico CRISPR ni utilizar ultracentrífuga; y (3) Elimina la necesidad de clonación de una sola célula.

El objetivo directo de este artículo fue eliminar el gen RIP1 en monocitos humanos U937. La forma canónica de la necroptosis de la vía de muerte celular altamente inflamatoria está controlada por RIP1, que sirve como objetivo fundamental para los estudios de muerte celular. 11,12,13,14 A medida que RIP1 se activa a través de la autofosforilación, recluta y causa la fosforilación directa y la activación de la serina/treonina-proteína quinasa 3 (RIPK3/RIP3) que interactúa con el receptor y la pseudoquinasa de linaje mixto (MLKL) para formar el necrosoma. Después de esta formación, el necrosoma, es libre de moverse por toda la célula para interactuar con orgánulos como las mitocondrias^12,13. En las mitocondrias, RIP1 potencia un ciclo de retroalimentación positiva con el metabolismo celular, lo que impacta directamente en la producción de ROS mitocondriales, que a su vez promueve una mayor autofosforilación de RIP1, la formación de necrosomas y la ejecución posterior de la necroptosis 11,12,13,14.

Si bien el enfoque del grupo de investigación actual es el papel de RIP1 en la muerte celular, otras razones para estudiar RIP1 incluyen sus roles en la inflamación y la infección. Al ser activado por receptores de muerte como los receptores TNF, RIP1 promueve la activación de la vía de señalización NF-κB, que desencadena la transcripción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas y otras moléculas esenciales para el reclutamiento de células inmunitarias y la amplificación de la respuesta inflamatoria¹⁵. Además de la activación de NF-κB, RIPK1 también puede activar las vías de señalización de MAPK, lo que mejora aún más la inflamación^15,16. En cuanto a su papel en las respuestas a la infección, RIP1 actúa como un mediador fundamental de la respuesta inflamatoria del huésped, particularmente en respuesta a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) reconocidos por receptores de reconocimiento de patrones (PRRs) como los receptores tipo Toll (TLRs)¹⁷. Además, durante la sepsis, RIP1 se activa mediante la señalización a través de receptores de muerte como el receptor TNF, lo que conduce al inicio de cascadas proinflamatorias. RIPK1 media la activación de las vías NF-κB y MAPK, promoviendo la producción de citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6, que son impulsores clave de la respuesta inflamatoria sistémica característica de la sepsis¹⁸.

Protocolo

En la Figura 1 se proporciona una representación esquemática del procedimiento. El ARN guía (ARNg) y la secuencia diana se indican en la Tabla 1. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recolección de vector de expresión lentiviral de ARNg CRISPR dirigido a RIP1 que contiene endonucleasa Cas9 y resistencia a la puromicina de Escherichia coli

1. E . coli de raya cuadrante que alberga ARNg vectorial lentiviralen placas de agar LB suplementadas con 100 μg/mL de ampicilina.
2. Incubar las placas a 37°C durante 1-2 días hasta que las colonias individuales sean visibles en la zona más diluida de la placa.
3. Seleccione una sola colonia con un asa estéril y agregue individualmente cada colonia a 5 mL de caldo LB suplementado con 100 μg/mL de ampicilina en un tubo cónico de 50 mL. Asegúrese de pipetear completamente hacia arriba y hacia abajo después de agregar la colonia individual para garantizar la homogeneización.
4. Ventile y pegue con cinta adhesiva la tapa del tubo cónico de 50 ml e incube en un agitador orbital a 37 °C y 225 rpm durante 8 h.
5. Durante las 8 h de incubación a 37 °C, añadir 40 mL de caldo LB suplementado con 100 μg/mL de ampicilina a cada uno de los cuatro tubos cónicos separados de 50 mL.
6. Después de la incubación de 8 h a 37 °C, tome 40 μL de E cultivado . colicultivo y añádalo a los cuatro tubos cónicos de 50 mL.
7. Ventile y pegue con cinta adhesiva los tapones de los tubos cónicos de 50 ml e incubelos en un agitador orbital a 37 °C y 225 rpm durante 12-16 h.
8. Después de esta incubación a 37 ° C, gire todos los tubos a 3220 x g en un rotor de cubo oscilante durante 20 minutos para granular la bacteria E. coli cultivada.
9. Decantar los sobrenadantes en un vaso de precipitados, luego combine los cuatro gránulos en 10 mL de caldo LB suplementado con 100 μg/mL de ampicilina.
10. Vuelva a girar los gránulos combinados a máxima velocidad en un rotor de cubo oscilante durante 20 minutos para obtener un pellet singular.
11. Deseche la mayor cantidad posible de sobrenadantes en el vaso de precipitados de residuos y proceda con una de las siguientes opciones: (1) Congele el pellet húmedo tal como está a -80° durante un máximo de 1 mes. (2) Proceda con la purificación de plásmidos de vectores lentivirales.
    NOTA: Si se elige la opción 1, el protocolo puede detenerse aquí.

2. Transfección de células HEK293T con vector de expresión lentiviral de ARNg CRISPR purificado dirigido a RIP1

1. Siembre HEK293T células durante la noche a una concentración de 3 × 10⁶ a 5 × 10⁶ células en una placa de 10 cm que contenga DMEM con 4,5 g/L de D-glucosa, L-glutamina, 110 mg/L de piruvato de sodio y 10 % de FBS inactivado por calor.
2. Al día siguiente, asegúrese de que las placas tengan aproximadamente un 70%-90% de confluencia, luego proceda con el protocolo.
3. Configure la transfección de las células con una proporción de plásmidos 1:1:1:1 (plásmido CRISPR experimental: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) utilizando el reactivo de transfección en una proporción de 3:1 (3 partes de reactivo: 1 parte de ADN plasmídico), junto con medio sérico reducido.
   NOTA: La porción de pLP1: pLP2: pLP/VSVG de la proporción es una mezcla de empaque lentiviral.
   1. Equilibre el reactivo de transfección, el medio sérico reducido, el ADN plasmídico CRISPR y la mezcla de empaquetado lentiviral a temperatura ambiente antes de configurar la transfección.
   2. Mezcle 75 μL del reactivo de transfección, 2500 μL de medio sérico reducido y 25 μg de ADN total (cálculo basado en el análisis de espectrofotómetro para ADN plasmídico CRISPR y proporción 1:1:1:1 con mezcla de empaquetado lentiviral).
   3. Deje que esta mezcla se incube a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. Pipetee con cuidado todo el volumen de esta mezcla en la placa de células HEK293T confluentes directamente en el medio (no es necesario cambiar el medio).
4. Gire suavemente la placa para asegurar una homogeneización adecuada de la mezcla de transfección y los medios de la placa. Incubar la placa a 37 °C durante 48 h.

3. Transducción lentiviral de células U937 o células diana

1. Una vez completada la incubación de 48 h a 37 ^°C , transfiera el medio de la placa de células de HEK293T productor a un tubo cónico de 15 mL.
2. Centrifugar el volumen a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente para granular las células HEK293T restantes. Retire todo el sobrenadante que contenga virus, teniendo cuidado de no alterar las células HEK293T peletizadas, y manténgalo en un tubo cónico separado de 15 ml. A continuación, descontamine y deseche el tubo que contiene pellets en el contenedor de residuos de riesgo biológico adecuado.
   NOTA: Los sobrenadantes de lentivirus a base de VIH pueden almacenarse a -80 °C; Sin embargo, hacerlo conlleva un riesgo de pérdida de hasta el 55% de la estabilidad del virus después del primer ciclo de congelación/descongelación¹⁹.
3. Contar y obtener un pellet de 2 × 10⁶ células U937 en un tubo cónico de 15 mL centrifugando un volumen adecuado a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente y decantar el sobrenadante, dejando el pellet de celda en el tubo.
4. Vuelva a suspender el pellet de célula U937 con todo el sobrenadante que contiene virus y, a continuación, centrifugue el tubo a 290 x g durante 60 min.
5. Después de la centrifugación, use una pipeta para volver a suspender el pellet con el sobrenadante que contiene el virus ya en el tubo.
6. Coloque el tubo en un rotor de extremo a extremo (o dispositivo giratorio similar) durante 60 minutos.
   1. Después de esta incubación, centrifugar los tubos a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente para granular las células.
   2. Vuelva a suspender el pellet de celda con una mezcla de medios en proporción 1:1 de sobrenadantes que contienen virus y medios RPMI-1640 completos complementados con FBS inactivado por calor al 10%.
7. Transfiera la mezcla celular a una placa de cultivo de tejidos de 10 cm e incube a 37 ° C durante 48 h.
8. Después de esta incubación, centrifugar las células U937 a 400 x g durante 10 min y eliminar el sobrenadante.
   1. Vuelva a suspender el pellet con medios RPMI-1640 completos suplementados con un 10% de FBS inactivado por calor y 5 μg/mL de puromicina y transfiera las células a un matraz T25.
   2. Incubar las células a 37 °C sin tocarlas durante 2-3 semanas, asegurándose de revisarlas cada 1-2 días para detectar signos de crecimiento celular.
      NOTA: Una vez que las células se vuelven confluentes y tienen un tiempo de renovación saludable después de un paso inicial, se puede probar la efectividad del protocolo completado.

4. Probar la efectividad del protocolo completado en la creación de células mutantes RIP1 CRISPR mediante análisis de Western blot

1. Genere lisados de proteínas celulares de monocitos U937 de tipo salvaje (WT), células CRISPR de control no objetivo (NTC) y células mutantes CRISPR RIP1 11,12,13.
2. Ejecute estos lisados en un gel SDS-PAGE y proceda con el análisis de Western blot¹⁴.
   1. Normalice primero las muestras a una proteína de limpieza.
   2. Después de la normalización, analice las muestras para determinar los niveles de expresión de la proteína RIP1 para determinar adecuadamente el éxito de la creación de una línea celular mutante CRISPR RIP1 ¹⁴.
3. Después de la conformación del análisis de Western blot, las células se pueden utilizar con fines de experimentación.

Resultados

Tras la producción de una población confluente de células U937 con mutación RIP1 CRISPR, se realizaron análisis SDS-PAGE y Western blot. El análisis de Western blot se utilizó para determinar la creación exitosa de una línea celular mutante RIP1 CRISPR mediante la evaluación de la pérdida de los niveles de expresión de la proteína RIP1. Esta determinación se realizó con base en el resultado comparativo de monocitos WT U937 y células NTC. En la

Discusión

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones detalladas y análisis de posibles trampas en la eficiencia y confiabilidad de la transfección y transducción lentiviral para crear una línea celular U937 knockout RIP1. A pesar de que este método de transfección y transducción requiere mucho trabajo y tiempo, generalmente se considera una forma eficiente de incorporar el ARNg y la endonucleasa Cas9 elegidos en líneas celulares difíciles de transfectar

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902