יצירת קו תאים RIP1 Knockout U937 באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Summary

ככל שפרוטוקולים הקשורים לקריספר הופכים שימושיים ונגישים יותר ויותר, סיבוכים ומכשולים עדיין יכולים להיווצר בתנאי ניסוי ספציפיים. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של קו תאים אנושיים נוקאאוט של סרין/תראונין-חלבון קינאז 1 (RIPK1/RIP1) באמצעות CRISPR/Cas9 ומדגיש אתגרים פוטנציאליים בהם נתקלים במהלך תהליך זה.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר נוהל להשמדת הגן RIP1 באמצעות CRISPR/Cas9 בקו תאי המונוציטים האנושיים U937. השיטה משתמשת בפלסמידים ייעודיים של RNA מדריך ופלסמידים של אריזות לנטי-ויראליות כדי להשיג נוקאאוט של הגן RIP1. הפרוטוקול מתמודד עם אתגרים ושיפורים בשיטות הקריספר המסורתיות, ומאפשר את שכפולו למחקרי מוות תאי עתידיים. ניתן להשתמש בתאים המוטנטיים המתקבלים כדי לחקור שינויים מכניסטיים במוות תאי, כאשר חלבוני RIP1 פונקציונליים היו ממלאים תפקיד אחרת. מבחני כדאיות הראו ירידה משמעותית במוות התאים בתאי נוקאאוט לאחר השראת נקרופטוזיס. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חשפה ירידה ניכרת במיני חמצן תגובתי מיטוכונדריאלי (ROS) בתאי נוקאאוט באותם תנאים. יחד, מבחנים פונקציונליים אלה מאשרים את אובדן חלבון RIP1. מותאם לשימוש עם מונוציטים אנושיים U937, הליך זה עשוי להיות מותאם גם כדי להתמקד בווסתי מוות תאים מרכזיים אחרים, ולהניב מוטציות פונקציונליות ולא קטלניות. מלכודות פוטנציאליות מטופלות לאורך כל הדרך כדי לספק תובנות לגבי אתגרים שעלולים להתעורר במהלך יצירת מוטאנטים.

Introduction

השימוש בטכנולוגיית עריכת הגנים CRISPR/Cas9 מתפתח במהירות מאז גילויה ^1,2,3. היכולת לדפוק או להפיל גנים בתוך קווי תאים או חיידקים היא בעלת ערך רב להעברת מחקר והבנת מנגנונים תוך-תאיים 1,2,3,4,5,6. מערכת CRISPR-Cas9 משפרת את שיטות עריכת הגנים הקודמות, כגון נוקלאז אפקטור דמוי מפעיל שעתוק (TALEN), על ידי פישוט הנדסת הספציפיות של הגנים. הליך זה כולל שני מרכיבים בסיסיים: RNA מנחה (gRNA) המשמש לאיתור יעד הגן המיועד, ו-Cas9, שהוא אנדונוקלאז המשנה את מיקום הגנום המיועד עם שבירת DNA דו-גדילית ^3,4. ה-gRNA ישמש כמדריך לאנדונוקלאז Cas9 לאתר וליזום את השבירה הדו-גדילית ברצף הגנטי המיועד באמצעות זיווג בסיסי ווטסון-קריק. התהליך המלא של עריכת הגנום על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כולל מכונות תאיות המתקנות את השברים הדו-גדיליים הללו ב-DNA באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) או רקומבינציה הומולוגית ^3,7. סביר יותר ש-NHEJ יתרחש, ולמעשה ייצור מוטציה בגנום שתביא לאובדן ביטוי לגן המטרה ^3,4.

מקורות מסחריים הצליחו ליצור ספריות של מטרות gRNA שניתן לבטא באמצעות גידול ובידוד חיידקים, מה שמשפר משמעותית את קלות השימוש בהם. עם זאת, המגבלה העיקרית של מערכת CRISPR/Cas9 היא הקושי להעביר את קומפלקס ה-gRNA וה-Cas9 לשורות תאי המטרה. מגבלות אלו מתעוררות בקווי תאי השעיה, מכיוון שהם מכונים בדרך כלל^קשים להעברה 8. שיטות טרנספקציה טיפוסיות אינן יעילות בדרך כלל בהעברת מערכת CRISPR/Cas9 לתאי תרחיף, וזו הסיבה ששיטות העברה ויראליות כמו טרנספקציה וטרנסדוקציה לנטי-ויראליות מתאימות יותר לסוג זה של קו תאים ^8,9.

סוג זה של טרנספקציה דורש וקטור לנטי-ויראלי המקודד את ה-gRNA ואנדונוקלאז Cas9 יחד עם תוספת פלסמידים של אריזות לנטי-ויראליות, המועברות לקו תאים המסוגל לייצר חלקיקים לנטי-ויראליים. קו תאים שנבחר בדרך כלל לתהליך זה הוא תאים HEK293T, מכיוון שהם קלים יותר להעברה ועובדים ביעילות רבה בהרכבה של gRNA ו-Cas9 ^9,10. חלקיקים אלה משתחררים לאחר מכן כ-lentiviruses לתוך ה-supernatant, שניתן להשתמש בהם כדי להמיר את ה-gRNA ו-Cas9 לקו תאי ההשעיה המיועד, כגון מונוציטים אנושיים U937. ככזה, ההליך המתואר כאן כולל את השינויים הבאים בהשוואה לשיטות מבוססות: (1) שיטת טרנספקציה חלופית עבור קווי תאים קשים לטרנספט; (2) אין צורך לרכז DNA פלסמיד CRISPR או להשתמש באולטרה-צנטריפוגה; ו-(3) זה מבטל את הצורך בשיבוט תא בודד.

המוקד הישיר של מאמר זה היה להפיל את הגן RIP1 במונוציטים אנושיים U937. הצורה הקאנונית של נקרופטוזיס מסלול מוות תאי דלקתי מאוד נשלטת על ידי RIP1, המשמש כמטרה מרכזית למחקרי מוות תאי. 11,12,13,14 כאשר RIP1 הופך לפעיל באמצעות אוטופוספורילציה, הוא מגייס וגורם לזרחון ישיר והפעלה של סרין/תראונין-חלבון קינאז 3 (RIPK3/RIP3) ופסאודוקינאז דמוי תחום קינאז (MLKL) ליצירת הנקרוזום. בעקבות היווצרות זו, הנקרוזום חופשי לנוע ברחבי התא כדי לקיים אינטראקציה עם אברונים כמו המיטוכונדריה^12,13. במיטוכונדריה, RIP1 מגביר לולאת משוב חיובית עם חילוף החומרים התאי, ומשפיע ישירות על ייצור ROS מיטוכונדריאלי, אשר בתורו מקדם אוטופוספורילציה נוספת של RIP1, היווצרות נמקוזומים וביצוע במורד הזרם של נקרופטוזיס 11,12,13,14.

בעוד שקבוצת המחקר הנוכחית מתמקדת בתפקידו של RIP1 במוות תאי, סיבות אחרות לחקור את RIP1 כוללות את תפקידיו בדלקת וזיהום. עם הפעלה על ידי קולטני מוות כגון קולטני TNF, RIP1 מקדם את הפעלת מסלול האיתות NF-κB, המפעיל שעתוק של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כימוקינים ומולקולות אחרות החיוניות לגיוס תאי חיסון ולהגברת התגובה הדלקתית¹⁵. בנוסף להפעלת NF-κB, RIPK1 יכול גם להפעיל מסלולי איתות MAPK, מה שמגביר עוד יותר את הדלקת^15,16. באשר לתפקידו בתגובות לזיהום, RIP1 פועל כמתווך מרכזי של התגובה הדלקתית של המארח, במיוחד בתגובה לדפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן (PAMPs) המזוהים על ידי קולטני זיהוי דפוסים (PRRs) כגון קולטנים דמויי אגרה (TLRs)¹⁷. יתר על כן, במהלך אלח דם, RIP1 מופעל על ידי איתות דרך קולטני מוות כגון קולטן TNF, מה שמוביל להתחלת מפלים פרו-דלקתיים. RIPK1 מתווך את הפעלת מסלולי NF-κB ו-MAPK, ומקדם ייצור של ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון TNF-α, IL-1β ו-IL-6, שהם מניעי מפתח לתגובה הדלקתית המערכתית האופיינית לאלח דם¹⁸.

Protocol

ייצוג סכמטי של ההליך מסופק באיור 1. RNA מנחה (gRNA) ורצף היעד ניתנים בטבלה 1. פרטי הריאגנטים והציוד המשמש מפורטים בטבלת החומרים.

1. קציר של וקטור ביטוי לנטי-ויראלי של CRISPR gRNA המכוון ל-RIP1 המכיל אנדונוקלאז Cas9 ועמידות לפורומיצין מ-Escherichia coli

1. E. coli עם פס רבוע המכיל gRNA וקטורי לנטי-ויראליעל לוחות אגר LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
2. דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים עד שמושבות בודדות נראות באזור המדולל ביותר בצלחת.
3. בחר מושבה בודדת עם לולאה סטרילית והוסף בנפרד כל מושבה ל-5 מ"ל מרק LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. הקפד לפיפטה ביסודיות למעלה ולמטה לאחר הוספת המושבה הבודדת כדי להבטיח הומוגניזציה.
4. אוורור והדביק את מכסה הצינור החרוטי בנפח 50 מ"ל ודגירה בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך 8 שעות.
5. במהלך הדגירה של 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, הוסף 40 מ"ל של מרק LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין לכל אחד מארבעת צינורות חרוטיים נפרדים של 50 מ"ל.
6. לאחר הדגירה של 8 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, יש ליטול 40 מיקרוליטר של מזרח מזרחי שגדל.תרבית קולי והוסף אותה לכל ארבעת הצינורות החרוטיים של 50 מ"ל.
7. אוורור והדביק את המכסים של הצינורות החרוטיים בנפח 50 מ"ל ודגר אותם בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס ו-225 סל"ד למשך 12-16 שעות.
8. לאחר הדגירה הזו ב-37 מעלות צלזיוס, סובבו את כל הצינורות ב-3220 x גרם ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות כדי לגלול את חיידקי ה-E. coli הגדלים.
9. שפכו סופרנטנטים לכוס פסולת, ואז שלבו את כל ארבעת הכדורים ב-10 מ"ל של מרק LB בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
10. סובב שוב את הכדורים המשולבים במהירות מקסימלית ברוטור דלי מתנדנד למשך 20 דקות כדי לקבל כדור יחיד.
11. השליכו כמה שיותר מהסופרנטנטים לכוס הפסולת, והמשיכו באחת מהאפשרויות הבאות: (1) הקפיאו את הכדור הרטוב בטמפרטורה של -80 מעלות למשך עד חודש. (2) המשך בטיהור פלסמיד וקטור לנטי-ויראלי.
    הערה: אם בוחרים באפשרות 1, ייתכן שהפרוטוקול יושהה כאן.

2. טרנספקציה של תאים HEK293T עם וקטור ביטוי לנטי-ויראלי מטוהר של CRISPR gRNA המכוון ל-RIP1

1. זרע HEK293T תאים למשך הלילה בריכוז של 3 × 10⁶ עד 5 × 10⁶ תאים לצלחת בגודל 10 ס"מ המכילה DMEM עם 4.5 גרם / ליטר D-גלוקוז, L-גלוטמין, 110 מ"ג / ליטר נתרן פירובט ו- 10% FBS מומת חום.
2. למחרת, ודא שללוחיות יש מפגש של כ-70%-90%, ולאחר מכן המשך עם הפרוטוקול.
3. הגדר את הטרנספקציה של התאים עם יחס של 1:1:1:1:1 של פלסמידים (פלסמיד CRISPR ניסיוני: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) באמצעות מגיב הטרנספקציה ביחס של 3:1 (מגיב 3 חלקים: 1 חלק DNA פלסמיד), יחד עם מדיום סרום מופחת.
   הערה: החלק pLP1: pLP2: pLP/VSVG של היחס הוא תערובת אריזה לנטיויראלית.
   1. איזון מגיב הטרנספקציה, מדיום סרום מופחת, DNA פלסמיד CRISPR ותערובת אריזות לנטי-ויראליות לטמפרטורת החדר לפני הגדרת הטרנספקציה.
   2. מערבבים יחד 75 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה, 2500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ו-25 מיקרוגרם DNA כולל (חישוב מבוסס על ניתוח ספקטרופוטומטר עבור DNA פלסמיד CRISPR ויחס של 1:1:1:1 עם תערובת אריזה לנטיויראלית).
   3. הניחו לתערובת זו לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15-30 דקות. פיפטה בזהירות את כל נפח התערובת הזו ללוח התא HEK293T המפגש ישירות לתוך המדיה (אין צורך להחליף מדיה).
4. סובב בעדינות את הצלחת כדי להבטיח הומוגניזציה נאותה של תערובת הטרנספקציה ואמצעי הצלחת. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.

3. התמרה לנטיוויראלית של תאי U937 או תאי מטרה

1. לאחר השלמת הדגירה של 48 שעות ^{ב-37 מעלות צלזיוס} , העבירו את המדיה מלוח התא HEK293T היצרן לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
2. צנטריפוגה בנפח 800 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את כל תאי HEK293T שנותרו. הסר את כל הסופרנטנט המכיל נגיף, הקפד לא להפריע לתאי HEK293T הכדורים, ושמור אותו בצינור חרוטי נפרד של 15 מ"ל. לאחר מכן, יש לטהר ולהשליך את הצינור המכיל גלולה במיכל הפסולת הביולוגית המתאים.
   הערה: ניתן לאחסן סופרנטנטים מבוססי HIV בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס; עם זאת, פעולה זו טומנת בחובה סיכון של עד 55% אובדן יציבות הנגיף לאחר מחזור ההקפאה/הפשרה הראשון¹⁹.
3. ספרו והשיגו כדור של 2 × 10⁶ תאי U937 בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה בנפח מתאים ב-400 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ושפכו את הסופרנטנט, והשאירו את כדור התא בצינור.
4. השעו מחדש את כדור התא U937 עם כל הסופרנטנט המכיל וירוס ולאחר מכן צנטריפוגה את הצינור ב-290 x גרם למשך 60 דקות.
5. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש את הכדור עם הסופרנטנט המכיל וירוס שכבר נמצא בצינורית.
6. הנח את הצינור על מסובב קצה קצה (או מכשיר מסתובב דומה) למשך 60 דקות.
   1. לאחר הדגירה הזו, צנטריפוגה את הצינורות ב-400 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים.
   2. יש להשעות מחדש את גלולת התא עם תערובת מדיה ביחס של 1:1 של סופרנטנטים המכילים וירוסים ומדיה מלאה של RPMI-1640 בתוספת FBS מושבת חום של 10%.
7. מעבירים את תערובת התאים לצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
8. לאחר הדגירה הזו, צנטריפוגה את תאי U937 ב-400 x g למשך 10 דקות והסר את הסופרנטנט.
   1. השעו מחדש את הגלולה עם מדיה מלאה של RPMI-1640 בתוספת 10% FBS מומת בחום ו-5 מיקרוגרם/מ"ל של פורומיצין והעבירו את התאים לבקבוק T25.
   2. דגרו על תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא מגע במשך 2-3 שבועות, והקפידו לבדוק אותם כל 1-2 ימים לאיתור סימני צמיחת תאים.
      הערה: ברגע שהתאים הופכים למתכנסים ויש להם זמן תחלופה בריא לאחר מעבר ראשוני, ניתן לבדוק את יעילות הפרוטוקול שהושלם.

4. בדיקת יעילות הפרוטוקול המושלם ביצירת תאים מוטנטיים RIP1 CRISPR באמצעות ניתוח כתמים מערביים

1. ליצור ליזטים של חלבון תאי של מונוציטים U937 מסוג בר (WT), תאי CRISPR לא מכוונים (NTC) ותאי מוטציה RIP1 CRISPR 11,12,13.
2. הפעל את הליזטים הללו על ג'ל SDS-PAGE והמשך בניתוח כתמים מערביים¹⁴.
   1. נרמל תחילה דגימות לחלבון משק בית.
   2. לאחר הנורמליזציה, נתח דגימות לרמות ביטוי חלבון RIP1 כדי לקבוע כראוי את ההצלחה של יצירת קו תאים מוטנטי RIP1 CRISPR¹⁴.
3. בעקבות קונפורמציה של ניתוח כתמים מערביים, ניתן להשתמש בתאים למטרות ניסוי.

תוצאות

בעקבות ייצור אוכלוסייה משולבת של תאי U937 מוטנטיים RIP1 CRISPR, בוצעו ניתוח SDS-PAGE וכתמים מערביים. ניתוח הכתם המערבי שימש לקביעת היצירה המוצלחת של קו תאים מוטנטי RIP1 CRISPR על ידי הערכת אובדן רמות ביטוי חלבון RIP1. קביעה זו נעשתה על סמך התוצאה ההשוואתית של מונוציטים WT U937 ותאי N...

Discussion

פרוטוקול זה נועד לספק הדרכה מפורטת וניתוח של מלכודות פוטנציאליות ביעילות ובאמינות של טרנספקציה והתמרה לנטי-ויראלית ליצירת קו תאים נוקאאוט U937 של RIP1. למרות ששיטה זו של טרנספקציה והתמרה היא עתירת עבודה וזמן, היא נחשבת בדרך כלל לדרך יעילה לשלב את ה-gRNA והאנדונוקלאז Cas9 ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902