Génération d’une lignée cellulaire RIP1 knockout U937 à l’aide du système CRISPR-Cas9

Résumé

À mesure que les protocoles liés à CRISPR deviennent de plus en plus utiles et accessibles, des complications et des obstacles peuvent encore survenir dans des conditions expérimentales spécifiques. Ce protocole décrit la création d’une lignée cellulaire humaine knock-out sérine/thréonine-protéine kinase 1 (RIPK1/RIP1) à l’aide de CRISPR/Cas9 et met en évidence les défis potentiels rencontrés au cours de ce processus.

Résumé

Ce protocole décrit une procédure permettant d’inactiver le gène RIP1 à l’aide de CRISPR/Cas9 dans la lignée cellulaire du monocyte humain U937. La méthode utilise des plasmides d’ARN guide désignés et des plasmides d’emballage lentiviral pour réaliser l’inactivation du gène RIP1. Le protocole relève les défis et améliore les méthodes CRISPR traditionnelles, permettant sa réplication pour de futures études sur la mort cellulaire. Les cellules mutantes résultantes peuvent être utilisées pour étudier les changements mécanistes dans la mort cellulaire, où les protéines fonctionnelles RIP1 joueraient autrement un rôle. Les tests de viabilité ont démontré une réduction significative de la mort cellulaire dans les cellules knock-out après l’induction de la nécroptose. La microscopie à fluorescence a révélé une diminution marquée des espèces réactives de l’oxygène (ROS) mitochondriales dans les cellules knock-out dans les mêmes conditions. Ensemble, ces tests fonctionnels confirment la perte de la protéine RIP1. Optimisée pour une utilisation avec des monocytes humains U937, cette procédure peut également être adaptée pour cibler d’autres régulateurs clés de la mort cellulaire, produisant des mutants fonctionnels et non létaux. Les pièges potentiels sont abordés tout au long du livre afin de donner un aperçu des défis qui peuvent survenir au cours de la génération mutante.

Introduction

L’utilisation de la technologie d’édition de gènes CRISPR/Cas9 a évolué rapidement depuis sa découverte ^1,2,3. La capacité d’inactiver ou d’inactiver des gènes au sein de lignées cellulaires ou de bactéries est inestimable pour faire avancer la recherche et la compréhension des mécanismes intracellulaires 1,2,3,4,5,6. Le système CRISPR-Cas9 améliore les méthodes d’édition de gènes précédentes, telles que la nucléase effectrice de type activateur de transcription (TALEN), en simplifiant l’ingénierie de la spécificité des gènes. Cette procédure comprend deux composants fondamentaux : l’ARN guide (ARNg) utilisé pour localiser la cible génique prévue, et Cas9, qui est une endonucléase qui modifie l’emplacement du génome prévu avec une cassure d’ADN double brin ^3,4. L’ARNg servira de guide à l’endonucléase Cas9 pour localiser et initier la cassure double brin au niveau de la séquence génétique prévue grâce à l’appariement des bases Watson-Crick. Le processus complet d’édition du génome par le système CRISPR/Cas9 implique la machinerie cellulaire qui répare ces cassures double brin de l’ADN par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) ou recombinaison homologue ^3,7. Il est plus probable que la NHEJ se produise, créant effectivement une mutation dans le génome qui entraîne une perte d’expression du gène cible ^3,4.

Des sources commerciales ont été en mesure de créer des banques de cibles d’ARNg qui peuvent être exprimées par la croissance bactérienne et l’isolement, ce qui améliore considérablement leur facilité d’utilisation. Cependant, la principale limitation du système CRISPR/Cas9 est la difficulté à délivrer l’ARNg et le complexe Cas9 dans les lignées cellulaires cibles. Ces limitations se produisent dans les lignées cellulaires en suspension, car elles sont généralement appelées 8 difficiles à transfecter^. Les méthodes de transfection typiques ne sont généralement pas efficaces pour délivrer le système CRISPR/Cas9 dans les cellules en suspension, c’est pourquoi les méthodes d’administration virale comme la transfection et la transduction lentivirales sont mieux adaptées à ce type de lignée cellulaire ^8,9.

Ce type de transfection nécessite un vecteur lentiviral qui code pour l’ARNg et l’endonucléase Cas9 ainsi que des plasmides d’emballage lentiviraux ajoutés, qui sont transfectés dans une lignée cellulaire capable de fabriquer des particules lentivirales. Une lignée cellulaire généralement choisie pour ce processus est celle des cellules HEK293T, car elles sont plus faciles à transfecter et fonctionnent très efficacement dans l’assemblage de l’ARNg et du Cas9 ^9,10. Ces particules sont ensuite libérées sous forme de lentivirus dans le surnageant, qui peut être utilisé pour transduire l’ARNg et Cas9 dans la lignée cellulaire en suspension prévue, telle que les monocytes humains U937. En tant que telle, la procédure décrite ici présente les changements suivants par rapport aux méthodes établies : (1) Méthode de transfection alternative pour les lignées cellulaires difficiles à transfecter ; (2) Pas besoin de concentrer l’ADN plasmidique CRISPR ou d’utiliser une ultracentrifugeuse ; et (3) il élimine le besoin de clonage d’une seule cellule.

L’objectif direct de cet article était d’inactiver le gène RIP1 dans les monocytes humains U937. La forme canonique de la nécroptose de la voie de mort cellulaire hautement inflammatoire est contrôlée par RIP1, qui sert de cible pivot pour les études sur la mort cellulaire. 11,12,13,14 Lorsque RIP1 devient actif par autophosphorylation, il recrute et provoque une phosphorylation directe et l’activation de la sérine/thréonine-protéine kinase 3 interagissant avec le récepteur (RIPK3/RIP3) et de la pseudokinase de type MLKL (Mixed Line Kinase domain-like) pour former le nécrosome. Suite à cette formation, le nécrosome est libre de se déplacer dans toute la cellule pour interagir avec des organites tels que les mitochondries^12,13. Au niveau des mitochondries, RIP1 potentialise une boucle de rétroaction positive avec le métabolisme cellulaire, impactant directement la production de ROS mitochondriaux, qui à leur tour favorisent l’autophosphorylation supplémentaire de RIP1, la formation de nécrosomes et l’exécution en aval de la nécroptose 11,12,13,14.

Bien que le groupe de recherche actuel se concentre sur le rôle de RIP1 dans la mort cellulaire, d’autres raisons d’étudier RIP1 incluent ses rôles dans l’inflammation et l’infection. Lors de l’activation par des récepteurs de mort tels que les récepteurs TNF, RIP1 favorise l’activation de la voie de signalisation NF-κB, qui déclenche la transcription de cytokines pro-inflammatoires, de chimiokines et d’autres molécules essentielles au recrutement des cellules immunitaires et à l’amplification de la réponse inflammatoire¹⁵. En plus de l’activation de NF-κB, RIPK1 peut également engager les voies de signalisation MAPK, améliorant encore l’inflammation^15,16. En ce qui concerne son rôle dans les réponses à l’infection, RIP1 agit comme un médiateur pivot de la réponse inflammatoire de l’hôte, en particulier en réponse aux motifs moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) reconnus par les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) tels que les récepteurs de type Toll (TLR)¹⁷. De plus, lors d’une septicémie, RIP1 est activé par signalisation par des récepteurs de mort tels que le récepteur TNF, conduisant à l’initiation de cascades pro-inflammatoires. RIPK1 médie l’activation des voies NF-κB et MAPK, favorisant la production de cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6, qui sont des facteurs clés de la réponse inflammatoire systémique caractéristique du sepsis¹⁸.

Protocole

Une représentation schématique de la procédure est fournie à la figure 1. L’ARN guide (ARNg) et la séquence cible sont donnés dans le tableau 1. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Récolte du vecteur d’expression lentivirale de l’ARNg CRISPR ciblant RIP1 contenant l’endonucléase Cas9 et la résistance à la puromycine d’Escherichia coli

1. E. coli à quadrant-stries hébergeant un ARNg du vecteur lentiviralsur des plaques de gélose LB complétées par 100 μg/mL d’ampicilline.
2. Incuber les plaques à 37 °C pendant 1 à 2 jours jusqu’à ce que les colonies individuelles soient visibles dans la zone la plus diluée de la plaque.
3. Sélectionnez une seule colonie avec une anse stérile et ajoutez individuellement chaque colonie à 5 mL de bouillon LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline dans un tube conique de 50 mL. Assurez-vous de bien pipeter de haut en bas après avoir ajouté la colonie unique pour assurer l’homogénéisation.
4. Aérez et collez le capuchon du tube conique de 50 ml et incubez dans un agitateur orbital à 37 °C et 225 tr/min pendant 8 h.
5. Pendant l’incubation de 8 h à 37 °C, ajouter 40 mL de bouillon LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline dans chacun des quatre tubes coniques distincts de 50 mL.
6. Après l’incubation de 8 h à 37 °C, prendre 40 μL d’E cultivé.coli et ajoutez-le aux quatre tubes coniques de 50 ml.
7. Aérez et collez les capuchons des tubes coniques de 50 ml et incuberez-les dans un agitateur orbital à 37 °C et 225 tr/min pendant 12 à 16 h.
8. Après cette incubation à 37 °C, faire tourner tous les tubes à 3220 x g dans un rotor à godets oscillants pendant 20 minutes pour granuler les bactéries E. coli cultivées.
9. Décanter les surnageants dans un bécher à déchets, puis mélanger les quatre granulés dans 10 ml de bouillon LB complété par 100 μg/mL d’ampicilline.
10. Faites tourner à nouveau les granulés combinés à la vitesse maximale dans un rotor à godets oscillant pendant 20 minutes pour obtenir un granulé unique.
11. Jetez autant de surnageants que possible dans le bécher à déchets et procédez avec l’une des options suivantes : (1) Congelez les granulés humides tels quels à -80° jusqu’à 1 mois. (2) Procéder à la purification du plasmide du vecteur lentiviral.
    REMARQUE : Si l’option 1 est choisie, le protocole peut être mis en pause ici.

2. Transfection de cellules HEK293T avec un vecteur d’expression lentivirale d’ARNg CRISPR purifié ciblant RIP1

1. Semez HEK293T cellules pendant la nuit à une concentration de 3 × 10⁶ à 5 × 10⁶ cellules dans une plaque de 10 cm contenant du DMEM contenant 4,5 g/L de D-glucose, de la L-glutamine, 110 mg/L de pyruvate de sodium et 10 % de FBS inactivé par la chaleur.
2. Le lendemain, assurez-vous que les plaques ont une confluence d’environ 70 % à 90 %, puis procédez au protocole.
3. Configurez la transfection des cellules avec un rapport de plasmides de 1:1:1:1 (plasmide CRISPR expérimental : pLP1 : pLP2 : pLP/VSVG) en utilisant le réactif de transfection dans un rapport de 3:1 (3 parties de réactif : 1 partie d’ADN plasmidique), ainsi qu’un milieu sérique réduit.
   REMARQUE : La portion pLP1 : pLP2 : pLP/VSVG du rapport est un mélange d’emballages lentiviraux.
   1. Équilibrez le réactif de transfection, le milieu sérique réduit, l’ADN plasmidique CRISPR et le mélange d’emballage lentiviral à température ambiante avant la configuration de la transfection.
   2. Mélangez 75 μL de réactif de transfection, 2500 μL de milieu sérique réduit et 25 μg d’ADN total (calcul basé sur l’analyse par spectrophotomètre pour l’ADN plasmidique CRISPR et le rapport 1:1:1:1 avec un mélange d’emballage lentiviral).
   3. Laisser incuber ce mélange à température ambiante pendant 15 à 30 min. Pipetez soigneusement tout le volume de ce mélange vers le confluent HEK293T la plaque cellulaire directement dans le milieu (pas besoin de changer de milieu).
4. Faites tourner doucement la plaque pour assurer une homogénéisation adéquate du mélange de transfection et du support de plaque. Incuber la plaque à 37 °C pendant 48 h.

3. Transduction lentivirale des cellules U937 ou des cellules cibles

1. Une fois l’incubation de 48 h à 37 ^°C terminée, transvaser le milieu du producteur HEK293T plaque cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
2. Centrifugez le volume à 800 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules de HEK293T restantes. Retirez tout le surnageant contenant le virus, en prenant soin de ne pas déranger les cellules de HEK293T granulées, et conservez-le dans un tube conique séparé de 15 ml. Ensuite, décontaminez et jetez le tube contenant des granulés dans le conteneur de déchets biologiques approprié pour les déchets biologiques.
   REMARQUE : Les surnageants de lentivirus à base de VIH peuvent être conservés à -80 °C ; Cependant, cela comporte un risque de perte de stabilité du virus pouvant aller jusqu’à 55 % après le premier cycle de gel/dégel¹⁹.
3. Compter et obtenir une pastille de 2 × 10⁶ cellules U937 dans un tube conique de 15 mL en centrifugant un volume approprié à 400 x g pendant 10 min à température ambiante et décanter le surnageant en laissant la pastille cellulaire dans le tube.
4. Remettre en suspension la pastille de cellule U937 avec tout le surnageant contenant le virus, puis centrifuger le tube à 290 x g pendant 60 min.
5. Après la centrifugation, à l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille avec le surnageant contenant le virus déjà dans le tube.
6. Placez le tube sur un rotateur d’un bout à l’autre (ou un dispositif rotatif similaire) pendant 60 min.
   1. Suite à cette incubation, centrifuger les tubes à 400 x g pendant 10 min à température ambiante pour granuler les cellules.
   2. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec un mélange de milieux à rapport 1:1 de surnageants contenant des virus et de milieux RPMI-1640 complets complétés par 10 % de FBS inactivé par la chaleur.
7. Transférez le mélange cellulaire dans une plaque de culture tissulaire de 10 cm et incubez à 37 °C pendant 48 h.
8. Après cette incubation, centrifuger les cellules U937 à 400 x g pendant 10 min et retirer le surnageant.
   1. Remettre la pastille en suspension avec un milieu RPMI-1640 complet complété par 10 % de FBS inactivé à la chaleur et 5 μg/mL de puromycine et transférer les cellules dans une fiole T25.
   2. Incuber les cellules à 37 °C sans les toucher pendant 2 à 3 semaines, en veillant à les surveiller tous les 1 à 2 jours pour détecter tout signe de croissance cellulaire.
      REMARQUE : Une fois que les cellules deviennent confluentes et ont un temps de renouvellement sain après un passage initial, elles peuvent être testées pour l’efficacité du protocole terminé.

4. Test de l’efficacité du protocole terminé dans la création de cellules mutantes CRISPR RIP1 à l’aide de l’analyse par transfert Western

1. Générer des lysats de protéines cellulaires de monocytes U937 de type sauvage (WT), de cellules CRISPR de contrôle non ciblé (NTC) et de cellules mutantes RIP1 CRISPR 11,12,13.
2. Exécutez ces lysats sur un gel SDS-PAGE et procédez à l’analyse par transfert Western¹⁴.
   1. Normalisez d’abord les échantillons en une protéine d’entretien.
   2. Après la normalisation, analysez les échantillons pour les niveaux d’expression de la protéine RIP1 afin de déterminer adéquatement le succès de la création d’une lignée cellulaire mutante RIP1 CRISPR¹⁴.
3. Après la conformation de l’analyse par transfert Western, les cellules peuvent être utilisées à des fins d’expérimentation.

Résultats

Suite à la production d’une population confluente de cellules U937 mutantes RIP1 CRISPR, des analyses SDS-PAGE et Western blot ont été effectuées. L’analyse par transfert Western a été utilisée pour déterminer la création réussie d’une lignée cellulaire mutante CRISPR RIP1 en évaluant la perte des niveaux d’expression de la protéine RIP1. Cette détermination a été faite sur la base du résultat comparatif des monocytes WT U937 et des cellules NTC...

Discussion

Ce protocole vise à fournir des instructions détaillées et une analyse des pièges potentiels dans l’efficacité et la fiabilité de la transfection et de la transduction lentivirales pour créer une lignée cellulaire U937 knock-out RIP1. Bien que cette méthode de transfection et de transduction demande beaucoup de travail et de temps, elle est généralement considérée comme un moyen efficace d’incorporer l’ARNg et l’endonucléase Cas9 choisis dans des lignées c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902