Geração de uma linha celular RIP1 knockout U937 usando o sistema CRISPR-Cas9

Resumo

À medida que os protocolos relacionados ao CRISPR se tornam cada vez mais úteis e acessíveis, complicações e obstáculos ainda podem surgir em condições experimentais específicas. Este protocolo descreve a criação de uma linha de células humanas nocaute serina/treonina-proteína quinase 1 (RIPK1/RIP1) que interage com o receptor usando CRISPR/Cas9 e destaca os possíveis desafios encontrados durante esse processo.

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento para nocautear o gene RIP1 usando CRISPR / Cas9 na linha celular de monócitos humanos U937. O método utiliza plasmídeos de RNA guia designados e plasmídeos de empacotamento lentiviral para atingir o nocaute do gene RIP1. O protocolo aborda desafios e melhorias nos métodos tradicionais de CRISPR, permitindo sua replicação para futuros estudos de morte celular. As células mutantes resultantes podem ser usadas para investigar mudanças mecanicistas na morte celular, onde as proteínas RIP1 funcionais desempenhariam um papel. Os ensaios de viabilidade demonstraram uma redução significativa na morte celular em células knockout após a indução da necroptose. A microscopia de fluorescência revelou uma diminuição acentuada nas espécies reativas de oxigênio mitocondriais (ROS) em células knockout sob as mesmas condições. Juntos, esses ensaios funcionais confirmam a perda da proteína RIP1. Otimizado para uso com monócitos humanos U937, este procedimento também pode ser adaptado para atingir outros reguladores de morte celular importantes, produzindo mutantes funcionais e não letais. Armadilhas potenciais são abordadas para fornecer informações sobre os desafios que podem surgir durante a geração de mutantes.

Introdução

O uso da tecnologia de edição de genes CRISPR/Cas9 tem evoluído rapidamente desde sua descoberta ^1,2,3. A capacidade de knock-in ou knockout genes dentro de linhagens celulares ou bactérias é inestimável para o encaminhamento de pesquisas e a compreensão dos mecanismos intracelulares 1,2,3,4,5,6. O sistema CRISPR-Cas9 melhora os métodos anteriores de edição de genes, como a nuclease efetora semelhante ao ativador de transcrição (TALEN), simplificando a engenharia da especificidade do gene. Esse procedimento inclui dois componentes fundamentais: RNA guia (gRNA) usado para localizar o alvo do gene pretendido e Cas9, que é uma endonuclease que modifica a localização do genoma pretendido com uma quebra de DNA de fita dupla ^3,4. O gRNA atuará como um guia para a endonuclease Cas9 localizar e iniciar a quebra de fita dupla na sequência genética pretendida por meio do emparelhamento de bases Watson-Crick. O processo completo de edição do genoma pelo sistema CRISPR / Cas9 envolve a maquinaria celular reparando essas quebras de fita dupla no DNA por meio de junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou recombinação homóloga ^3,7. É mais provável que ocorra NHEJ, criando efetivamente uma mutação no genoma que resulta em perda de expressão do gene alvo ^3,4.

Fontes comerciais foram capazes de criar bibliotecas de alvos de gRNA que podem ser expressos por meio do crescimento e isolamento bacteriano, o que melhora significativamente sua facilidade de uso. No entanto, a principal limitação do sistema CRISPR/Cas9 é a dificuldade em entregar o gRNA e o complexo Cas9 em linhagens celulares-alvo. Essas limitações surgem em linhagens de células em suspensão, pois são geralmente chamadas de difíceis de transfectar⁸. Os métodos típicos de transfecção geralmente não são eficientes na entrega do sistema CRISPR / Cas9 em células em suspensão, e é por isso que os métodos de entrega viral, como transfecção lentiviral e transdução, são mais adequados para esse tipo de linha celular ^8,9.

Este tipo de transfecção requer um vetor lentiviral que codifica o gRNA e a endonuclease Cas9 junto com plasmídeos de empacotamento lentiviral adicionados, que são transfectados em uma linha celular capaz de fabricar partículas lentivirais. Uma linhagem celular tipicamente escolhida para esse processo é a HEK293T células, pois são mais fáceis de transfectar e trabalham de forma muito eficiente na montagem de gRNA e Cas9 ^9,10. Essas partículas são então liberadas como lentivírus no sobrenadante, que pode ser usado para transduzir o gRNA e Cas9 na linha celular de suspensão pretendida, como os monócitos humanos U937. Como tal, o procedimento aqui descrito apresenta as seguintes alterações em relação aos métodos estabelecidos: (1) Método alternativo de transfecção para linhagens celulares difíceis de transfectar; (2) Não há necessidade de concentrar o DNA do plasmídeo CRISPR ou usar ultracentrífuga; e (3) Elimina a necessidade de clonagem de célula única.

O foco direto deste artigo foi nocautear o gene RIP1 em monócitos humanos U937. A forma canônica da necroptose da via de morte celular altamente inflamatória é controlada por RIP1, que serve como um alvo central para estudos de morte celular. 11,12,13,14 À medida que o RIP1 se torna ativo por meio da autofosforilação, ele recruta e causa fosforilação direta e ativação da serina / treonina-proteína quinase 3 (RIPK3 / RIP3) e pseudoquinase semelhante ao domínio da quinase de linhagem mista (MLKL) para formar o necrossomo. Após essa formação, o necrossomo fica livre para se mover por toda a célula para interagir com organelas como as mitocôndrias^12,13. Nas mitocôndrias, o RIP1 potencializa um ciclo de feedback positivo com o metabolismo celular, impactando diretamente a produção de ROS mitocondrial, que por sua vez promove a autofosforilação adicional de RIP1, a formação de necrossomos e a execução a jusante da necroptose 11,12,13,14.

Embora o foco do grupo de pesquisa atual seja o papel do RIP1 na morte celular, outras razões para estudar o RIP1 incluem seus papéis na inflamação e infecção. Após a ativação por receptores de morte, como os receptores de TNF, o RIP1 promove a ativação da via de sinalização NF-κB, que desencadeia a transcrição de citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e outras moléculas essenciais para o recrutamento de células imunes e a amplificação da resposta inflamatória¹⁵. Além da ativação do NF-κB, o RIPK1 também pode envolver as vias de sinalização MAPK, aumentando ainda mais a inflamação ^15,16. Em relação ao seu papel nas respostas à infecção, o RIP1 atua como um mediador fundamental da resposta inflamatória do hospedeiro, particularmente em resposta a padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs)¹⁷. Além disso, durante a sepse, o RIP1 é ativado pela sinalização através de receptores de morte, como o receptor de TNF, levando ao início de cascatas pró-inflamatórias. O RIPK1 medeia a ativação das vias NF-κB e MAPK, promovendo a produção de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α, IL-1β e IL-6, que são os principais impulsionadores da resposta inflamatória sistêmica característica da sepse¹⁸.

Protocolo

Uma representação esquemática do procedimento é fornecida na Figura 1. O RNA guia (gRNA) e a sequência alvo são fornecidos na Tabela 1. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Colheita do vetor de expressão lentiviral CRISPR gRNA direcionado a RIP1 contendo endonuclease Cas9 e resistência à puromicina de Escherichia coli

1. E. coli com faixa de quadrante abrigando gRNA de vetor lentiviralem placas de ágar LB suplementadas com 100 μg / mL de ampicilina.
2. Incube as placas a 37 ° C por 1-2 dias até que as colônias individuais sejam visíveis na área mais diluída da placa.
3. Selecione uma única colônia com uma alça estéril e adicione individualmente cada colônia a 5 mL de caldo LB suplementado com 100 μg / mL de ampicilina em um tubo cônico de 50 mL. Certifique-se de pipetar completamente para cima e para baixo depois de adicionar a colônia única para garantir a homogeneização.
4. Ventile e prenda com fita adesiva a tampa do tubo cônico de 50 mL e incube em um agitador orbital a 37 ° C e 225 rpm por 8 h.
5. Durante a incubação de 8 h a 37 ° C, adicione 40 mL de caldo LB suplementado com 100 μg / mL de ampicilina a cada um dos quatro tubos cônicos separados de 50 mL.
6. Após a incubação de 8 h a 37 ° C, tome 40 μL de E crescido . cultura de coli e adicioná-lo a todos os quatro tubos cônicos de 50 mL.
7. Ventile e prenda com fita adesiva as tampas dos tubos cônicos de 50 mL e incuba-os em um agitador orbital a 37 ° C e 225 rpm por 12-16 h.
8. Após esta incubação a 37 ° C, gire todos os tubos a 3220 x g em um rotor de caçamba oscilante por 20 min para pellet da bactéria E. coli crescida.
9. Decantar os sobrenadantes para um copo de resíduos e, em seguida, combinar todos os quatro pellets em 10 mL de caldo LB suplementado com 100 μg / mL de ampicilina.
10. Gire os pellets combinados novamente na velocidade máxima em um rotor de caçamba oscilante por 20 min para obter um pellet singular.
11. Descarte o máximo possível de sobrenadantes no copo de resíduos e prossiga com uma das seguintes opções: (1) Congele o pellet úmido a -80° por até 1 mês. (2) Prossiga com a purificação do plasmídeo do vetor lentiviral.
    NOTA: Se a opção 1 for escolhida, o protocolo pode ser pausado aqui.

2. Transfecção de células HEK293T com vetor de expressão lentiviral CRISPR gRNA purificado visando RIP1

1. Semear HEK293T células durante a noite a uma concentração de 3 × 10⁶ a 5 × 10⁶ células em uma placa de 10 cm contendo DMEM com 4,5 g/L de D-glicose, L-glutamina, 110 mg/L de piruvato de sódio e 10% de FBS inativado pelo calor.
2. No dia seguinte, certifique-se de que as placas tenham aproximadamente 70% -90% de confluência e, em seguida, prossiga com o protocolo.
3. Configure a transfecção das células com uma proporção de 1:1:1:1 de plasmídeos (plasmídeo CRISPR experimental: pLP1: pLP2: pLP/VSVG) usando o reagente de transfecção em uma proporção de 3:1 (3 partes de reagente: 1 parte de DNA de plasmídeo), juntamente com meio de soro reduzido.
   NOTA: A porção pLP1: pLP2: pLP/VSVG da proporção é uma mistura de embalagens lentivirais.
   1. Equilibre o reagente de transfecção, o meio de soro reduzido, o DNA do plasmídeo CRISPR e a mistura de embalagens lentivirais à temperatura ambiente antes da configuração da transfecção.
   2. Misture 75 μL do reagente de transfecção, 2500 μL de meio de soro reduzido e 25 μg de DNA total (cálculo baseado na análise do espectrofotômetro para DNA de plasmídeo CRISPR e proporção de 1:1:1:1 com mistura de embalagem lentiviral).
   3. Deixe esta mistura incubar em temperatura ambiente por 15-30 min. Pipete cuidadosamente todo o volume desta mistura para a placa de célula HEK293T confluente diretamente no meio (sem necessidade de trocar de meio).
4. Gire suavemente a placa para garantir a homogeneização adequada da mistura de transfecção e do meio da placa. Incubar a placa a 37 °C durante 48 h.

3. Transdução lentiviral de células U937 ou células-alvo

1. Quando a incubação de 48 horas a 37 ^{° C} estiver concluída, transfira o meio da placa de célula HEK293T do produtor para um tubo cônico de 15 mL.
2. Centrifugue o volume a 800 x g por 5 min em temperatura ambiente para peletar as células HEK293T restantes. Remova todo o sobrenadante contendo vírus, tomando cuidado para não perturbar as células HEK293T peletizadas, e mantenha-o em um tubo cônico separado de 15 mL. Em seguida, descontamine e descarte o tubo contendo pellets no recipiente apropriado de resíduos de risco biológico.
   NOTA: Os sobrenadantes de lentivírus à base de HIV podem ser armazenados a -80°C; no entanto, isso acarreta um risco de perda de até 55% da estabilidade do vírus após o primeiro ciclo de congelamento/descongelamento¹⁹.
3. Contar e obter um sedimento de 2 × 10⁶ células U937 num tubo cónico de 15 ml, centrifugando um volume adequado a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente e decantar o sobrenadante, deixando o sedimento de célula no tubo.
4. Ressuspenda o pellet de célula U937 com todo o sobrenadante contendo vírus e, em seguida, centrifugue o tubo a 290 x g por 60 min.
5. Após a centrifugação, use uma pipeta para ressuspender o pellet com o sobrenadante contendo vírus já no tubo.
6. Coloque o tubo em um rotador de ponta a ponta (ou dispositivo rotativo semelhante) por 60 min.
   1. Após esta incubação, centrifugue os tubos a 400 x g por 10 min em temperatura ambiente para peletizar as células.
   2. Ressuspenda o pellet celular com uma mistura de mídia de proporção de 1:1 de ambos os sobrenadantes contendo vírus e mídia RPMI-1640 completa suplementada com 10% de FBS inativado por calor.
7. Transferir a mistura celular para uma placa de cultura de tecidos de 10 cm e incubar a 37°C durante 48 h.
8. Após esta incubação, centrifugue as células U937 a 400 x g por 10 min e remova o sobrenadante.
   1. Ressuspenda o pellet com meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% de FBS inativado por calor e 5 μg / mL de puromicina e transfira as células para um frasco T25.
   2. Incube as células a 37 °C intocadas por 2-3 semanas, certificando-se de verificá-las a cada 1-2 dias em busca de sinais de crescimento celular.
      NOTA: Uma vez que as células se tornam confluentes e têm um tempo de renovação saudável após uma passagem inicial, elas podem ser testadas quanto à eficácia do protocolo concluído.

4. Testando a eficácia do protocolo concluído na criação de células mutantes RIP1 CRISPR usando análise de Western blot

1. Gerar lisados de proteínas celulares de monócitos U937 de tipo selvagem (WT), células CRISPR de controle não direcionado (NTC) e células mutantes RIP1 CRISPR 11,12,13.
2. Execute esses lisados em um gel SDS-PAGE e prossiga com a análise de Western blot¹⁴.
   1. Normalize as amostras para uma proteína de limpeza primeiro.
   2. Após a normalização, analise as amostras quanto aos níveis de expressão da proteína RIP1 para determinar adequadamente o sucesso da criação de uma linha celular mutante RIP1 CRISPR¹⁴.
3. Após a conformação da análise de western blot, as células podem ser usadas para fins de experimentação.

Resultados

Após a produção de uma população confluente de células U937 mutantes RIP1 CRISPR, foram realizadas análises de SDS-PAGE e Western blot. A análise de Western blot foi usada para determinar a criação bem-sucedida de uma linhagem celular mutante RIP1 CRISPR, avaliando a perda dos níveis de expressão da proteína RIP1. Essa determinação foi feita com base no resultado comparativo dos monócitos WT U937 e células NTC. Na Figura 2,...

Discussão

Este protocolo visa fornecer instruções detalhadas e análises de possíveis armadilhas na eficiência e confiabilidade da transfecção e transdução lentiviral para criar uma linhagem celular U937 nocaute RIP1. Embora esse método de transfecção e transdução seja trabalhoso e demorado, geralmente é considerado uma maneira eficiente de incorporar o gRNA escolhido e a endonuclease Cas9 em linhagens celulares difíceis de transfectar ^8,9,20

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902