CRISPR-Cas9システムを用いた RIP1 ノックアウトU937細胞株の作製

要約

CRISPR関連のプロトコルがますます有用で利用しやすくなるにつれて、特定の実験条件下では依然として合併症や障害が発生する可能性があります。このプロトコールでは、CRISPR/Cas9を使用した受容体相互作用セリン/スレオニン-プロテインキナーゼ1(RIPK1/RIP1)ノックアウトヒト細胞株の作製を概説し、このプロセスで遭遇する可能性のある課題を強調しています。

要約

このプロトコールは、ヒト単球U937細胞株のCRISPR/Cas9を使用して RIP1 遺伝子をノックアウトする手順を概説しています。この方法では、指定されたガイドRNAプラスミドとレンチウイルスパッケージングプラスミドを利用して、RIP1遺伝子ノックアウトを達成します。このプロトコールは、従来のCRISPR法の課題と改善に対処し、将来の細胞死研究のための複製を可能にします。得られた変異細胞は、機能的なRIP1タンパク質が役割を果たす細胞死の機構的変化を調べるために使用できます。生存率アッセイでは、ネクロプトーシス導入後のノックアウト細胞における細胞死の有意な減少が示されました。蛍光顕微鏡法では、同じ条件下でノックアウト細胞のミトコンドリア活性酸素種(ROS)が著しく減少していることが明らかになりました。これらの機能アッセイを組み合わせることで、RIP1タンパク質の損失が確認されます。U937ヒト単球での使用に最適化されたこの手順は、他の主要な細胞死調節因子を標的とするようにも適応させることができ、機能的で非致死的な変異体をもたらします。潜在的な落とし穴は、ミュータント生成中に発生する可能性のある課題についての洞察を提供するために、全体を通して対処されます。

概要

CRISPR/Cas9遺伝子編集技術の利用は、その発見以来急速に進化しています^1,2,3。細胞株や細菌内の遺伝子をノックインまたはノックアウトする能力は、研究を進め、細胞内メカニズムを理解するために非常に貴重です1,2,3,4,5,6。CRISPR-Cas9システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)などの従来の遺伝子編集法を改良し、遺伝子特異性のエンジニアリングを簡素化します。この手順には、目的の遺伝子ターゲットを見つけるために使用されるガイドRNA(gRNA)と、二本鎖^DNA切断3,4で目的のゲノム位置を変更するエンドヌクレアーゼであるCas9の2つの基本的なコンポーネントが含まれます。gRNAは、Cas9エンドヌクレアーゼがWatson-Crick塩基対形成を通じて目的の遺伝子配列で二本鎖切断を特定し、開始するためのガイドとして機能します。CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集の全プロセスには、非相同末端結合(NHEJ)または相同^組換え3,7を通じてDNAのこれらの二本鎖切断を修復する細胞機構が含まれます。NHEJが起こり、ゲノムに突然変異が効果的に生じ、標的遺伝子の発現が失われる可能性の方が高い^3,4。

市販のソースでは、細菌の増殖と単離を通じて発現できるgRNAターゲットのライブラリを作成することができ、それにより、その使いやすさが大幅に向上しています。しかし、CRISPR/Cas9システムの主な制限は、gRNAとCas9複合体を標的細胞株に導入するのが難しいことです。これらの制限は、一般にトランスフェクションが難しい8と呼ばれる浮遊細胞株で^{発生します。}一般的なトランスフェクション法は、一般にCRISPR/Cas9システムを浮遊細胞に導入するのに効率的ではないため、レンチウイルストランスフェクションや形質導入などのウイルス導入法がこのタイプの細胞株により適しています^8,9。

このタイプのトランスフェクションには、gRNAとCas9エンドヌクレアーゼをコードするレンチウイルスベクターと、レンチウイルス粒子を製造できる細胞株にトランスフェクションするレンチウイルスパッケージングプラスミドが必要です。このプロセスで一般的に選択される細胞株は、トランスフェクションが容易で、gRNAとCas9 ^9,10の組み立てに非常に効率的に働くHEK293T細胞です。その後、これらの粒子はレンチウイルスとして上清に放出され、これを使用してgRNAとCas9を目的の浮遊細胞株(U937ヒト単球など)に形質導入することができます。そのため、ここで説明する手順は、確立された方法と比較して次の変更があります:(1)トランスフェクションが困難な細胞株の代替トランスフェクション方法;(2)CRISPRプラスミドDNAを濃縮したり、超遠心分離機を使用したりする必要はありません。(3)シングルセルクローニングの必要性を排除します。

この記事の直接的な焦点は、U937ヒト単球のRIP1遺伝子をノックアウトすることでした。炎症性の高い細胞死経路ネクロプトーシスの標準的な形態は、細胞死研究の極めて重要な標的として機能するRIP1によって制御されています。 11,12,13,14 RIP1が自己リン酸化によって活性化すると、受容体相互作用するセリン/スレオニン-プロテインキナーゼ3(RIPK3/RIP3)および混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)シュードキナーゼの直接リン酸化と活性化をリクルートしてネクロソームを形成します。この形成に続いて、ネクロソームは細胞内を自由に移動して、ミトコンドリアなどのオルガネラと相互作用する^12,13。ミトコンドリアでは、RIP1は細胞代謝による正のフィードバックループを増強し、ミトコンドリアROSの産生に直接影響を与え、その結果、RIP1のさらなる自己リン酸化、ネクロソーム形成、およびネクロプトーシスの下流の実行が促進されます11,12,13,14。

現在の研究グループは、細胞死におけるRIP1の役割に焦点を当てていますが、RIP1を研究する他の理由には、炎症と感染におけるRIP1の役割が含まれます。TNF受容体などの死受容体によって活性化されると、RIP1はNF-κBシグナル伝達経路の活性化を促進し、免疫細胞の動員と炎症応答の増幅に不可欠な炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン、およびその他の分子の転写を引き起こします¹⁵。NF-κBの活性化に加えて、RIPK1はMAPKシグナル伝達経路にも関与し、炎症をさらに増強することができます^15,16。感染への応答におけるその役割に関して、RIP1は、特にToll様受容体(TLR)などのパターン認識受容体(PRR)によって認識される病原体関連分子パターン(PAMP)に応答して、宿主の炎症反応の重要なメディエーターとして機能します¹⁷。さらに、敗血症では、RIP1はTNF受容体などの死受容体を介したシグナル伝達によって活性化され、炎症誘発性カスケードの開始につながります。RIPK1は、NF-κB経路およびMAPK経路の活性化を媒介し、敗血症¹⁸に特徴的な全身性炎症反応の主要なドライバーであるTNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症誘発性サイトカインの産生を促進します。

プロトコル

この手順の概略図を 図 1 に示します。ガイドRNA(gRNA)と標的配列を表1に示します。試薬および使用した機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. 大腸菌由来のCas9エンドヌクレアーゼとピューロマイシン耐性を含有するRIP1標的CRISPR gRNAレンチウイルス発現ベクターの採取

1. クオドラントストリーク大 腸菌 は、100 μg/mL アンピシリンを添加した LB 寒天プレート上に レンチウイルスベクター gRNA を抱いています。
2. プレートを37°Cで1〜2日間インキュベートし、プレートの最も希薄な領域に個々のコロニーが見えるようにします。
3. 滅菌ループのある単一のコロニーを選択し、各コロニーを100 μg/mLのアンピシリンを添加した5 mLのLBブロスを50 mLのコニカルチューブに個別に追加します。均質化を確実にするために、単一のコロニーを追加した後、完全に上下にピペットで移動するようにしてください。
4. 50 mLコニカルチューブのキャップをベントしてテープで留め、37°C、225 rpmのオービタルシェーカーで8時間インキュベートします。
5. 37°Cでの8時間インキュベーション中に、100 μg/mLのアンピシリンを添加した40 mLのLBブロスを、4本の別々の50 mLコニカルチューブのそれぞれに加えます。
6. 37°Cで8時間インキュベートした後、増殖したEを40μL取ります 。 大腸菌を培養し、4本の50 mLコニカルチューブすべてに加えます。
7. 50 mLコニカルチューブのキャップをベントしてテープで留め、37°C、225 rpmのオービタルシェーカーで12〜16時間インキュベートします。
8. このインキュベーションを37°Cで行い、すべてのチューブをスイングバケットローターで3220 x g で20分間スピンダウンし、増殖した 大腸菌 をペレット化します。
9. 上清を廃ビーカーにデカントし、4つのペレットすべてを100 μg/mLのアンピシリンを添加した10 mLのLBブロスに混ぜ合わせます。
10. 結合したペレットをスイングバケットローターで最高速度で20分間再び回転ダウンして、単一のペレットを取得します。
11. できるだけ多くの上清を廃棄物ビーカーに捨て、次のいずれかのオプションに進みます:(1)湿ったペレットを最大1か月間-80°で凍結します。(2)レンチウイルスベクタープラスミドの精製を進めます。
    注: オプション 1 を選択した場合、ここでプロトコルが一時停止される場合があります。

2. RIP1を標的とした精製CRISPR gRNAレンチウイルス発現ベクターによるHEK293T細胞へのトランスフェクション

1. 4.5 g/L D-グルコース、L-グルタミン、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム、および10 %の熱不活化FBSを含むDMEMを含むDMEMを含む10 cmプレートに、3 × 10⁶ 〜5 × 10⁶ 細胞の濃度でHEK293T細胞を一晩播種します。
2. 翌日、プレートのコンフルエント度が約70%〜90%であることを確認してから、プロトコールを進めます。
3. プラスミド(実験用CRISPRプラスミド:pLP1:pLP2:pLP/VSVG)の比率が1:1:1:1の比率で、トランスフェクション試薬を3:1の割合(試薬3部:プラスミドDNA:プラスミド1部)で細胞のトランスフェクションをセットアップします。また、血清培地も減少しています。
   注:比率のpLP1:pLP2:pLP / VSVG部分はレンチウイルス包装混合物です。
   1. トランスフェクションをセットアップする前に、トランスフェクション試薬、還元血清培地、CRISPRプラスミドDNA、およびレンチウイルスパッケージングミックスを室温で平衡化します。
   2. トランスフェクション試薬75 μL、還元血清培地2500 μL、および全DNA25 μgを混合します(CRISPRプラスミドDNAの分光光度計分析に基づく計算と、レンチウイルスパッケージングミックスによる1:1:1:1の比率)。
   3. この混合物を室温で15〜30分間インキュベートします。この混合物の全容量をコンフルエントHEK293Tセルプレートに慎重にピペットで入れます(培地を交換する必要はありません)。
4. プレートを静かに渦巻かせて、トランスフェクションミックスとプレート培地が適切に均質化されるようにします。プレートを37°Cで48時間インキュベートします。

3. U937細胞または標的細胞のレンチウイルス形質導入

1. 37^°C での48時間インキュベーションが完了したら、培地をプロデューサー HEK293Tセルプレートから15 mLのコニカルチューブに移します。
2. 容量を800 x g で室温で5分間遠心分離し、残りのHEK293T細胞をペレット化します。ペレット化されたHEK293T細胞を乱さないように注意しながら、ウイルスを含む上清をすべて取り除き、別の15mLの円錐管に保管します。次に、ペレット含有チューブを除染し、適切なバイオハザード廃棄物容器に廃棄します。
   注:HIVベースのレンチウイルス上清は-80°Cで保存できます。ただし、これを行うと、最初の凍結/融解サイクル¹⁹後にウイルスの安定性が最大55%失われるリスクがあります。
3. 室温で400 x gの適切な容量を10分間遠心分離することにより、15 mLのコニカルチューブに2個×10個の⁶ U937細胞のペレットをカウントして取得し、上清をデカンタントして、細胞ペレットをチューブ内に残します。
4. U937細胞ペレットをすべてのウイルス含有上清で再懸濁し、チューブを290 x g で60分間遠心分離します。
5. 遠心分離後、ピペットを使用して、ウイルス含有上清がすでにチューブ内にあるペレットを再懸濁します。
6. チューブをエンドオーバーエンドローテーター(または同様の回転装置)に60分間置きます。
   1. このインキュベーション後、チューブを400 x g で室温で10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
   2. ウイルス含有上清と10%熱不活化FBSを添加した完全なRPMI-1640培地の両方を1:1の比率で混合した培地で細胞ペレットを再懸濁します。
7. 細胞混合物を10 cmの組織培養プレートに移し、37°Cで48時間インキュベートします。
8. このインキュベーション後、U937細胞を400 x g で10分間遠心分離し、上清を除去します。
   1. 10%熱不活化FBSと5 μg/mLのピューロマイシンを添加した完全なRPMI-1640培地でペレットを再懸濁し、細胞をT25フラスコに移します。
   2. 細胞を手つかずで37°Cで2〜3週間インキュベートし、細胞増殖の兆候がないか1〜2日ごとに確認するようにしてください。
      注:細胞がコンフルエントになり、最初の継代後に健康なターンオーバー時間を持つようになったら、完了したプロトコルの有効性についてテストできます。

4. ウェスタンブロット解析を用いた RIP1 CRISPR変異細胞の作製における完成プロトコールの有効性の検証

1. 野生型(WT)U937単球、ノンターゲティングコントロール(NTC)CRISPR細胞、およびRIP1 CRISPR変異体細胞11,12,13の細胞タンパク質ライセートを作製する。
2. これらのライセートをSDS-PAGEゲル上で分析し、ウェスタンブロット解析¹⁴に進みます。
   1. 最初にサンプルをハウスキーピングタンパク質に正規化します。
   2. 標準化後、RIP1タンパク質の発現レベルについてサンプルを分析し、 RIP1 CRISPR変異細胞株¹⁴の作製成功を適切に判断します。
3. ウェスタンブロット解析のコンフォメーションに従って、細胞を実験目的に使用することができます。

結果

RIP1 CRISPR変異U937細胞のコンフルエント集団の作製に続いて、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析を行った。ウェスタンブロット解析を使用して、RIP1タンパク質発現レベルの損失を評価することにより、RIP1 CRISPR変異細胞株の作製に成功しました。この決定は、WT U937単球とNTC細胞との比較結果に基づいて行われました。図2では、RI...

ディスカッション

このプロトコルは、レンチウイルストランスフェクションとRIP1ノックアウトU937細胞株を作成するための形質導入の効率と信頼性の潜在的な落とし穴について詳細な指示と分析を提供することを目的としています。このトランスフェクションおよび形質導入の方法は、手間と時間がかかりますが、一般に、選択したgRNAおよびCas9エンドヌクレアーゼをトランス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adjusted DMEM Medium	Gibco	11995-040
Ampicillin	Sigma	A1593
bisBenzimide Hoechst 33342 trihydrochloride	Sigma	B2261
Complete RPMI-1640 Medium	Sigma	R6504
CRISPR NTC gRNA E.coli Strain	transOMIC	TELA1011
CRISPR RIP1 gRNA E.coli Strain	transOMIC	TEVH-1162203
End-over-end Rotator	Thermo Scientific
EVOS FL Fluorescence Microscope	Life Technologies
GenElute Plasmid Maxiprep Kit	Sigma	PLX15
Goat Anti-Rabbit IgG Antibody, (H+L) HRP conjugate	Sigma	AP307P
HEK293T Cells	ATCC
Incubator Shaker	New Brunswick Scientific
LB Agar	BD	244520
LB Broth	BD	244610
LV-MAX Lentiviral Packaging Mix	Gibco	A43237
MitoSOX Red	MedChemExpress	HY-D1055
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Scientific
Necrostatin-1	MedChemExpress	HY-14622A
OPTI-MEM	Gibco	31985-062
Puromycin	Sigma	P7255
Rabbit anti-human RIP1 mAb	Cell Signaling Technology	3493
SDS-PAGE and western blot equipment	BioRad
TNF-α	MedChemExpress	HY-P7058
U937 Human Monocytes	ATCC
WST-1 Cell Proliferation Assay System	TaKaRa	MK400
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Diagnostics	6365779001
z-VAD-FMK	APExBIO	A1902